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1、基基 因因 工工 程程基基因因工工程程基基本本流流程程第二章 分子克隆单元操作2.2 2.3 2.1 用于基因克隆的载体用于基因克隆的载体dnadna的体外重组（切与接）的体外重组（切与接）目的基因的克隆目的基因的克隆2.4 基因操作常用技术基因操作常用技术转化与扩增（转与增）转化与扩增（转与增）转化子的筛选与重组子的鉴定（检）转化子的筛选与重组子的鉴定（检）2.5 2.6 n基因工程课程内容5 2 3 4 1 6 7 基因工程概论基因工程概论分子克隆单元操作分子克隆单元操作大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程真菌基因工程真菌基因工程高等动物基因工程高等动物基因工程高等植物基因工程高等植物基因工程
2、蛋白质工程、途径工程蛋白质工程、途径工程2.1 2.1 用于基因克隆的载体用于基因克隆的载体质粒载体质粒载体噬菌体或病毒载体噬菌体或病毒载体考斯质粒与噬菌粒考斯质粒与噬菌粒人工染色体载体人工染色体载体载体的基本概念载体的基本概念一、载体的基本概念一、载体的基本概念一、载体的基本概念一、载体的基本概念载体（载体（载体（载体（vectorvectorvectorvector）：）：）：）：是把外源是把外源是把外源是把外源dnadnadnadna（目的基因）导入宿主细胞，（目的基因）导入宿主细胞，（目的基因）导入宿主细胞，（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增或表达的工具。使之传代、扩增或表达的工
3、具。使之传代、扩增或表达的工具。使之传代、扩增或表达的工具。载体的主要功能：载体的主要功能：载体的主要功能：载体的主要功能：运载：运载：高效运载高效运载外源基因至受体细胞内外源基因至受体细胞内维持：维持：自主复制或整合至宿主基因组，以达传代目的自主复制或整合至宿主基因组，以达传代目的扩增：扩增：使外源基因拷贝数增加（使外源基因拷贝数增加（克隆载体）克隆载体）表达：表达：为目的基因表达为目的基因表达提供顺式元件（提供顺式元件（表达载体表达载体）2 2、载体应具备的条件、载体应具备的条件、载体应具备的条件、载体应具备的条件可转移性：可转移性：具有针对受体细胞的具有针对受体细胞的“ “亲缘性亲缘性”
4、 ”或或“ “亲和性亲和性” ”（导入效率）（导入效率） 可筛选性可筛选性：具有合适的：具有合适的筛选标记筛选标记 具有一定的装载能力：具有一定的装载能力：在插入外源基因后仍能有效转化宿主在插入外源基因后仍能有效转化宿主基因文库构建需要非常大的容量基因文库构建需要非常大的容量方便外源基因克隆：方便外源基因克隆：具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 ( (多克隆位点多克隆位点 ) )可传代性：可传代性：具有与特定受体细胞相适应的具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点（稳定遗传）复制位点或整合位点（稳定遗传） 3 3、载体类型、载体类型、载体类型、载体类型
5、克隆载体（克隆载体（cloning vectorcloning vector）主要用于在大肠杆菌细胞中克隆目的基因，或在大肠主要用于在大肠杆菌细胞中克隆目的基因，或在大肠杆菌或酿酒酵母细胞中构建基因文库。杆菌或酿酒酵母细胞中构建基因文库。表达载体（表达载体（expression vector)expression vector)除含基因克隆所需元件外，还有供外源基因表达用的启除含基因克隆所需元件外，还有供外源基因表达用的启动子、终止子等顺式元件，用于在特定的宿主中表达目动子、终止子等顺式元件，用于在特定的宿主中表达目的基因。的基因。1 1）按功能分：）按功能分：）按功能分：）按功能分：3 3、
6、载体类型、载体类型、载体类型、载体类型自主复制型载体自主复制型载体含复制子，可独立于宿主染色体外复制与传代。含复制子，可独立于宿主染色体外复制与传代。 穿梭载体穿梭载体装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆整合型载体整合型载体不含复制子，需借助同源重组机制整合于宿主不含复制子，需借助同源重组机制整合于宿主基因组。基因组。2 2）按传代特性分：）按传代特性分：）按传代特性分：）按传代特性分：3 3、载体类型、载体类型、载体类型、载体类型质粒（质粒（plasmid)plasmid)噬菌体（噬菌体（bacteriophage)/bacteriophage
7、)/病毒病毒(virus)(virus)考斯质粒（考斯质粒（cosmidcosmid） 噬菌粒（噬菌粒（phagemidphagemid）人工染色体（人工染色体（yacyac，bacbac）3 3）按来源分：）按来源分：）按来源分：）按来源分：二、质粒二、质粒二、质粒二、质粒(plasmid)(plasmid)质粒的生物学特性质粒的生物学特性质粒载体的特点与类型质粒载体的特点与类型几个重要的质粒载体几个重要的质粒载体质粒的制备与鉴定质粒的制备与鉴定（一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性质粒：质粒：是生物细胞内固有的、能独立于宿主染色体而是生物细
8、胞内固有的、能独立于宿主染色体而自主复制自主复制、并、并被被稳定遗传稳定遗传的一类的一类dnadna分子。分子。* *质粒常见于原核细菌和真菌中质粒常见于原核细菌和真菌中* *绝大多数的天然绝大多数的天然dnadna质粒具有质粒具有共价、封闭、环状的共价、封闭、环状的分子结构，分子结构，即即cccdnacccdna（covalently closed circular dna)covalently closed circular dna)* *质粒质粒dnadna的分子量范围：的分子量范围：1 - 1 - 300 kb300 kb1 1、质粒的自主复制性、质粒的自主复制性质粒是独立的复制子质粒
9、是独立的复制子（repliconreplicon）：）：含含复制起始复制起始复制起始复制起始位点（位点（位点（位点（origin, origin, oriori ) )和控制和控制和控制和控制复制频率的调控基因复制频率的调控基因复制频率的调控基因复制频率的调控基因 能利用宿主细胞的能利用宿主细胞的dnadna复制复制系统进行自主复制系统进行自主复制( ori )质粒的复制调控：调控区紧邻质粒的复制调控：调控区紧邻oriori，方便构建，方便构建调控区编码调控区编码rnairnai（反义）和（反义）和roprop蛋白，抑制复制引物蛋白，抑制复制引物rnaiirnaii与模与模板结合板结合orio
10、rie.coli e.coli cole1cole1 plasmidplasmid复制方向复制方向roprop（ ）roproprna iirna ii（引物）（引物）（引物）（引物）rna irna i3355553363个氨基酸个氨基酸,提高提高rnai的抑制的抑制阐述质粒阐述质粒阐述质粒阐述质粒dnadna复制调控机理的分子模型复制调控机理的分子模型复制调控机理的分子模型复制调控机理的分子模型1 1、抑制蛋白质稀释模型、抑制蛋白质稀释模型、抑制蛋白质稀释模型、抑制蛋白质稀释模型2 2、自体阻遏蛋白质模型、自体阻遏蛋白质模型、自体阻遏蛋白质模型、自体阻遏蛋白质模型调控区编码抑制蛋白调控
11、区编码抑制蛋白copcop，控制复制起始因子与复制起始位点，控制复制起始因子与复制起始位点（oriori）的结合的结合pcoppcopcopcopp/orepp/oreprepreporioricopcopreprep起始因子起始因子抑制蛋白质抑制蛋白质如何通过质粒改造提高质粒的拷贝数？如何通过质粒改造提高质粒的拷贝数？根据质粒复制调控的严密程度，质粒可分为两大复制类型：根据质粒复制调控的严密程度，质粒可分为两大复制类型：严紧型严紧型复制控制的复制控制的质粒：质粒： 1 - 3 1 - 3 拷贝，如拷贝，如psc101psc101松弛型松弛型复制控制的复制控制的质粒：质粒： 10 - 60 1
12、0 - 60 拷贝，如拷贝，如 cole1cole1氯霉素扩增：氯霉素扩增：在宿主菌生长的中后期，通过添加氯霉素在宿主菌生长的中后期，通过添加氯霉素抑制蛋白质合成、关闭主要代谢途径，以使抑制蛋白质合成、关闭主要代谢途径，以使松弛型质粒松弛型质粒 迅速大量扩增（可达上千拷贝）的操作。迅速大量扩增（可达上千拷贝）的操作。2 2 2 2、质粒的不相容性、质粒的不相容性、质粒的不相容性、质粒的不相容性质粒的不相容性：质粒的不相容性：任何两种含有任何两种含有相似复制子结构相似复制子结构的不同质粒，的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中的现象。不相容性的质粒组成不能同时存在于一个细胞中的现象。不相容性的质粒
13、组成不不相容性群相容性群以大肠杆菌的质粒为例：以大肠杆菌的质粒为例：cole1cole1、pmb1 pmb1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容psc101psc101、f f、rp4 rp4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15ap15a及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容质粒的不相容性的分子机制质粒的不相容性的分子机制两种两种含有相似复制子结构的不同质粒含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，拷贝
14、数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，可导致子代细胞质粒组成不同，且这种差异具随机性，经过可导致子代细胞质粒组成不同，且这种差异具随机性，经过若干代后宿主细胞中处于数量弱势的质粒必然被淘汰，而仅若干代后宿主细胞中处于数量弱势的质粒必然被淘汰，而仅剩强势质粒。剩强势质粒。3 3 3 3、质粒的可转移性、质粒的可转移性、质粒的可转移性、质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如另一个细胞（接合作用），如f f、colcol、rr质粒等
15、质粒等如如colcol、rr的的其它成员其它成员非接合型质粒非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用不能在天然条件下独立地发生接合作用值得注意的是，某些非接合型质粒（值得注意的是，某些非接合型质粒（cole1cole1）在接合型质粒在接合型质粒的存在和协助下，也能发生的存在和协助下，也能发生dnadna转移，这个过程由转移，这个过程由 bom bom 和和mob mob 基因决定基因决定4 4 4 4、携带特殊的遗传标记、携带特殊的遗传标记、携带特殊的遗传标记、携带特殊的遗传标记野生型的质粒野生型的质粒dnadna上往往携带一个或多个遗传标记基因，这上往往携带一个或多个遗传标记基因，这
16、使得宿主生物产生使得宿主生物产生正常生长非必需的正常生长非必需的附加性状，包括：附加性状，包括：物质抗性物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对这些标记基因对dnadna重组分子的筛选具有重要意义重组分子的筛选具有重要意义天然质粒的改造天然质粒的改造天然质粒的改造天然质粒的改造野生型质粒的缺点：野生型质粒的缺点： 分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想改造策略：改造策略：去掉复制和维持非必须序列；失活复制负调
17、控序列；去掉复制和维持非必须序列；失活复制负调控序列；引入多克隆位点；引入理想的筛选标记基因引入多克隆位点；引入理想的筛选标记基因psc101 psc101 8.8 kb 8.8 kb 拷贝数拷贝数 5 5 四环素抗性标记基因四环素抗性标记基因 tctcrrcole1 cole1 6.5 kb 6.5 kb 拷贝数拷贝数 20 - 30 20 - 30 大肠杆菌大肠杆菌内毒素标记基因内毒素标记基因 e1e1rsf2124rsf2124 cole1 cole1衍生质粒衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因氨苄青霉素抗性标记基因 apaprr野野生生质质粒粒第二次课第二次课第二次课第二次课选择性标记：选
18、择性标记：选择性标记：选择性标记：供重组子筛供重组子筛供重组子筛供重组子筛选用的遗传标记基因选用的遗传标记基因选用的遗传标记基因选用的遗传标记基因 多克隆位点（多克隆位点（mcsmcs）供外源基因插入的、供外源基因插入的、由单一切点内切酶组由单一切点内切酶组成的序列成的序列（二）质粒载体的特点与类型（二）质粒载体的特点与类型（二）质粒载体的特点与类型（二）质粒载体的特点与类型质粒载体关键元件：质粒载体关键元件：质粒载体关键元件：质粒载体关键元件：复制位点、选择性标记、多克隆位点复制位点、选择性标记、多克隆位点复制位点：复制位点：复制位点：复制位点：供自主复制用供自主复制用供自主复制用供自主复制
19、用的由复制起始位点和调控的由复制起始位点和调控的由复制起始位点和调控的由复制起始位点和调控基因组成的短序列基因组成的短序列基因组成的短序列基因组成的短序列质粒载体的特点：质粒载体的特点：质粒载体的特点：质粒载体的特点：分子量小，便于操作分子量小，便于操作易于构建，可作为其他宿主系统载体的骨架易于构建，可作为其他宿主系统载体的骨架用途广泛用途广泛缺点：缺点：装载量小（小于装载量小（小于10kb10kb），不能用来克隆大片段），不能用来克隆大片段（二）质粒载体的类型（二）质粒载体的类型（二）质粒载体的类型（二）质粒载体的类型人工构建的质粒载体根据其功能和用途可分成如下几类：人工构建的质粒载体根据其
20、功能和用途可分成如下几类： 高拷贝质粒高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因突变拷贝数控制基因 拷贝数拷贝数1000-3000 1000-3000 扩增基因扩增基因低拷贝质粒低拷贝质粒 来自来自psc101 psc101 拷贝数小于拷贝数小于1010 表达某些毒性基因表达某些毒性基因温敏质粒温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒测序质粒 含有测序通用引物互补序列含有测序通用引物互补序列整合质粒整合质粒 装有促进整合的基因，便于外源基因的整合装有促进整合的基因，便于外源基因的整合穿梭质粒穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆装有针
21、对两种不同受体的复制子，便于基因克隆表达质粒表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒探针质粒 装有报告基因，便于启动子等元件的克隆筛选装有报告基因，便于启动子等元件的克隆筛选（三）重要的大肠杆菌质粒载体（三）重要的大肠杆菌质粒载体（三）重要的大肠杆菌质粒载体（三）重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制松弛型复制 1 1、pbr322pbr322： 氯霉素可扩增氯霉素可扩增拷贝数拷贝数 50 - 100 / 50 - 100 / cellcell用于用于基因克隆基因克隆 2 2、puc18 puc18 / 19/ 19：最优秀的常规克隆
22、载体最优秀的常规克隆载体最优秀的常规克隆载体最优秀的常规克隆载体 拷贝数拷贝数 2000 - 3000 2000 - 3000 / / cellcell用于基因克隆和测序，用于基因克隆和测序，用于基因克隆和测序，用于基因克隆和测序，t t t t载载载载体的母载体体的母载体体的母载体体的母载体 装有多克隆位点（装有多克隆位点（mcsmcs）含含apap和正选择颜色标记和正选择颜色标记 laczlaczpuc18 puc18 / 19/ 19：正选择标记正选择标记 lacz lacz 的显色原理的显色原理（互补）互补）puc18puc18/19/19placplaclaczlaczmcsmcsb
23、b-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的-肽段肽段 b b b b b b5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚基吲哚基-bb-d-d-半乳糖半乳糖苷苷x-galx-gal半乳糖半乳糖 5-溴溴-4-靛蓝靛蓝3 3、t t载体：克隆载体：克隆载体：克隆载体：克隆pcrpcr产物用产物用产物用产物用来自来自puc18/19puc18/19多克隆位点中某处线多克隆位点中某处线性化，加装碱基性化，加装碱基t t，以便和以便和pcrpcr产物的产物的a a互补。互补。此处线性化，加此处线性化，加t4 4、pgempgem：多拷贝多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（装有多克隆位点
24、（mcsmcs）正选择颜色标记正选择颜色标记 laczlacz用于用于外源基因的高效表达外源基因的高效表达 注意：注意：t7t7和和sp6sp6启动子特异性地由噬菌体启动子特异性地由噬菌体dnadna编码的编码的rnarna聚合酶聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体rnarna聚合酶，如：聚合酶，如：2743 bp2743 bpmcsmcslaczlaczppt7t7orioriapaprrpgem-3epgem-3ep psp6sp6e.colie.coli bl21 bl21（de3de3）等等（四）质粒（四）质粒（四）质粒（四）质粒dnadn
25、adnadna的制备与鉴定的制备与鉴定的制备与鉴定的制备与鉴定实验室一般使用下列三种方法制备质粒实验室一般使用下列三种方法制备质粒dnadna： 氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法 质粒质粒dnadna纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染碱裂解法碱裂解法 质粒质粒dnadna纯度底、快速、操作简便纯度底、快速、操作简便沸水浴法沸水浴法 质粒质粒dnadna纯度、操作周期介于氯化铯法和沸水浴法之间纯度、操作周期介于氯化铯法和沸水浴法之间氯化铯密度梯度离心法：氯化铯密度梯度离心法： 对质粒的构象要求较高时采用对质粒的构象要求较高时采用用含有用含有edt
26、aedta的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加加csclcscl和溴乙锭和溴乙锭超速离心过夜超速离心过夜在紫外灯下吸取在紫外灯下吸取cccdnacccdna稀释沉淀稀释沉淀cccdnacccdnaproteinsproteinsocdnaocdnal-dnal-dnacccdnacccdnarnasrnas第三次课第三次课碱裂解法：碱裂解法：碱裂解法：碱裂解法： 最常用最常用用含有用含有edtaedta的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加加naohnaoh和和sdssds的混合溶液，去膜释放内含物的混合
27、溶液，去膜释放内含物 加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体色体dnadna及大部分蛋白质及大部分蛋白质 离心取上清液，用苯酚离心取上清液，用苯酚- -氯仿萃取，去除痕量的蛋白质氯仿萃取，去除痕量的蛋白质乙醇或异丙醇沉淀水相质粒乙醇或异丙醇沉淀水相质粒dnadna用无用无dnasednase的的rnasernase去除残余的去除残余的rnarna cccdnacccdnal-dnal-dnaocdnaocdna沸水浴法：沸水浴法：沸水浴法：沸水浴法： 用含有用含有edtaedta和和triton x-100triton x-100的缓冲液悬浮菌体的
28、缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁 沸水浴沸水浴4040秒钟秒钟离心，用无菌牙签挑去沉淀物离心，用无菌牙签挑去沉淀物 乙醇或异丙醇沉淀质粒乙醇或异丙醇沉淀质粒dnadna二、噬菌体或病毒二、噬菌体或病毒二、噬菌体或病毒二、噬菌体或病毒dnadnadnadna噬菌体：噬菌体：细菌的病毒，常开发为克隆载体细菌的病毒，常开发为克隆载体病毒：病毒：动、植物的病毒，常开发为表达载体动、植物的病毒，常开发为表达载体共同特点：共同特点：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增自主复制繁殖性能使
29、外源基因在受体细胞中高效扩增可在裂解和溶原二种状态间转换可在裂解和溶原二种状态间转换噬菌体或病毒噬菌体或病毒dnadna（一）大肠杆菌的（一）大肠杆菌的（一）大肠杆菌的（一）大肠杆菌的 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体dnadna1 1、l l 噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性：l l 噬菌体是噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体大肠杆菌的温和型噬菌体l l 噬菌体噬菌体由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和l l-dna-dna组组成成 l l-dna-dna全长全长4850248502个核苷个核苷酸酸l l-dna-dna上上至少有至少有6161个基因个基因 噬菌体的基因组结构噬菌体的基因组结构噬菌体的
30、基因组结构噬菌体的基因组结构5 tccagcggcgggg5 tccagcggcgggg3333cccgccgctgga 5 cccgccgctgga 5 coscoscoscoscoscos位点（位点（12bp12bp）头部合成基因头部合成基因尾部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因溶菌控制基因晚期控制基因晚期控制基因dnadna合成控制合成控制基因基因阻遏基因阻遏基因早期控制基因早期控制基因阻遏基因阻遏基因重组基因重组基因删除与整合基因删除与整合基因 - dna- dna 噬菌体的裂解周期噬菌体的裂解周期噬菌体的裂解周期噬菌体的裂解周期e.colie.coli吸附吸附lamblamb受体受体注
31、入注入复制复制包装包装裂解裂解lamb受体：麦芽糖转运蛋白受体：麦芽糖转运蛋白被狗咬了一口被狗咬了一口 噬菌体的体内包装噬菌体的体内包装噬菌体的体内包装噬菌体的体内包装 包装范围为原包装范围为原dnadna的的75 - 105u - 105%： 3636 - - 5151 kbkb体内包装体内包装100100个左右的拷贝个左右的拷贝包装范围为原包装范围为原dnadna的的75 - 105u - 105%即即 3636 - - 5151 kbkbddaa串连多聚体经滚环式复制形成串联重复经滚环式复制形成串联重复l l 噬菌体的溶原状态噬菌体的溶原状态 l l噬噬菌菌体体感感染染大大肠肠杆
32、杆菌菌后后，除除能能裂裂解解细细胞胞外外，也也可可能能将将其其dnadna直直接接整整合合到到宿宿主主细细胞胞的的染染色色体体dnadna上上，并并不不产产生生子子代代噬噬菌菌体体颗颗粒粒，这这种种情情况况为为溶溶原原状状态态。整整合合主主要要由由l l-dna-dna上上的的cici和和intint两两基基因因的的产产物物所所激激活活，而而这这两两个个基基因因的的开开放放与与关关闭闭又又取取决决于于宿宿主主细细胞胞本本身身的的性性质质。人人们们可可以以根根据据需需要要改改变变l l-dna-dna或或宿宿主主细细胞胞的性质，使噬菌体或处于的性质，使噬菌体或处于溶菌状态溶菌状态，或处于溶原状态
33、，或处于溶原状态 dna dna重组技术一般需要重组技术一般需要l l噬菌体进入溶菌状态噬菌体进入溶菌状态2 2 2 2、 -dna-dna载体的构建：载体的构建：载体的构建：载体的构建：1 1）缩短长度：）缩短长度：）缩短长度：）缩短长度：按有效包装范围确定按有效包装范围确定按有效包装范围确定按有效包装范围确定 野野生生型型l l-dna-dna包包装装的的上上限限为为5151kbkb，本本身身长长度度为为48.548.5kbkb，只只有有当当插插入入的的外外源源dnadna片片段段不不大大于于2.52.5kbkb时时，才才能能被被包包装装成成有有感感染染力力的的噬噬菌菌体体颗颗粒粒。因因此
34、此缩缩短短野野生生型型l l-dna-dna的的长长度度，可可以以提提高高装装载载量量。其其实实野野生生型型l l-dna-dna上上约约有有40-50@-50%的的片片段段是是复复制制和和裂裂解解所非必需的所非必需的。根据切除的多少，可将。根据切除的多少，可将l l-dna-dna分成两大类载体：分成两大类载体： 插入型载体插入型载体插入型载体插入型载体取代型载体取代型载体取代型载体取代型载体 插入型插入型插入型插入型 -dna-dna载体：载体：载体：载体：载量为载量为载量为载量为0-14kb0-14kb本身长度为包装下限，可以被包装。需使用载体标记基因进行筛选本身长度为包装下限，可以
35、被包装。需使用载体标记基因进行筛选本身长度为包装下限，可以被包装。需使用载体标记基因进行筛选本身长度为包装下限，可以被包装。需使用载体标记基因进行筛选体外包装体外包装插入位点插入位点体外包装体外包装插入片段插入片段载体长度载体长度 37 37 kbkb插入片段大小：插入片段大小：0 - 14 0 - 14 kbkb（51 3751 37）取代型取代型取代型取代型 -dna-dna载体：载体：载体：载体：载量为载量为载量为载量为10-25kb10-25kb本身长度为本身长度为本身长度为本身长度为40kb40kb，须切开，须切开，须切开，须切开14kb14kb。可以不需要标记基因。可以不需要标记基
36、因。可以不需要标记基因。可以不需要标记基因体外包装体外包装体外包装体外包装插入片段插入片段最小装载长度最小装载长度 10 10 kbkb（51 2651 26）载体长度载体长度 26 26 kbkb插入片段插入片段最大装载长度最大装载长度 25 25 kbkb（36 2636 26）酶切口酶切口2 2）删除重复的酶切位点，引入多克隆位点删除重复的酶切位点，引入多克隆位点野生型的野生型的l l-dna-dna链上有链上有5 5个个ecoriecori位点和位点和7 7个个hindiiihindiii位点，位点，不利于重组操作，必须删除至不利于重组操作，必须删除至1 - 21 - 2个个同时，为了
37、便于各种来源的同时，为了便于各种来源的dnadna片段的克隆，还需要增加片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点一些单一的酶切位点除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点酶位点3 3 3 3）加装选择标记加装选择标记加装选择标记加装选择标记与质粒不同，野生型与质粒不同，野生型l l-dna-dna上缺少合适的选择标记，因上缺少合适的选择标记，因此此加装加装选择标记是选择标记是l l-dna-dna克隆载体构建的重要内容克隆载体构建的重要内容l l-dna-dna克隆载体上的选择标记主要有下列两类：克隆载体上的选择标记主要有下列两
38、类：免疫功能类标记免疫功能类标记颜色反应类标记颜色反应类标记加装选择标记：加装选择标记：加装选择标记：加装选择标记： imm434imm434imm434imm434基因编码一种阻止基因编码一种阻止l l- -噬菌体进噬菌体进入入溶菌溶菌循环的循环的阻遏物阻遏物。含有完整标记基。含有完整标记基因的因的l l- -载体进入受体细胞后，建立载体进入受体细胞后，建立溶原溶原状态，细菌生长缓慢，形成状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑浑浊斑；当；当外源外源dnadna插入到标记基因中，基因灭活，插入到标记基因中，基因灭活， l l- -重组分子便进入重组分子便进入溶菌溶菌循环，形成循环，形成透明透明斑斑透明
39、斑透明斑浑浊斑浑浊斑加装选择标记：加装选择标记：加装选择标记：加装选择标记：laczlaczlaczlacz基因编码基因编码b b- -半乳糖苷酶，能催化半乳糖苷酶，能催化无色的无色的x-galx-gal生成蓝色化合物。当外源基生成蓝色化合物。当外源基因插入到因插入到laczlacz基因中，基因灭活，不能基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体合成蓝色化合物；而空载体l l-dna-dna则则产产生蓝色透明斑生蓝色透明斑4 4 4 4）构建琥珀密码子的突变体（环保的需要）构建琥珀密码子的突变体（环保的需要）构建琥珀密码子的突变体（环保的需要）构建琥珀密码子的突变体（环保的需要） 琥珀型突
40、变（琥珀型突变（supsup) )：由由cagcag（glngln）向向uaguag（stopstop）的突变。的突变。大大肠肠杆杆菌菌的的某某些些菌菌株株含含有有特特异异性性的的校校正正基基因因，其其编编码码产产物物校校正正trnatrna能专一性地纠正这一突变。能专一性地纠正这一突变。将将野野生生型型l l-dna-dna上上dd和和e e两两个个头头部部包包装装蛋蛋白白的的基基因因中中的的cagcag密密码码子子突突变变成成uaguag。当当这这种种l l-dna-dna进进入入一一般般的的大大肠肠杆杆菌菌菌菌株株后后，不不能能合合成成有有活活性性的的头头部部蛋蛋白白，也也就就不不能能被
41、被包包装装和和裂裂解解细细菌菌，这这样样就就可可以以阻阻止止有有害害重重组组体体的的生生物物污污染染及及扩扩散散，而而基基因因工工程程实实验验中中使使用用的的受体受体则是具有则是具有琥珀型突变体校正琥珀型突变体校正功能的菌株功能的菌株 3 3 3 3、 -dna-dna载体的主要类型：载体的主要类型：载体的主要类型：载体的主要类型：插入灭活型载体插入灭活型载体charoncharon2 2、charoncharon6 6、l lgt11gt11取代型载体取代型载体l lembl4embl4、l lgtgtl lc c、l lnm762nm762、charoncharon4040正选择型载体正选
42、择型载体l lembl1embl1、l ll47l47、l l10591059野生型的野生型的l l噬菌体不能在噬菌体不能在p2p2噬菌体溶源性噬菌体溶源性的细菌中繁殖（的细菌中繁殖（spispi ），），这种生长抑制表型受这种生长抑制表型受l l-dna-dna上的上的redred和和gamgam两个基因控制。若将外两个基因控制。若将外源源dnadna取代取代redred和和gamgam，重组重组噬菌体便拥有噬菌体便拥有spispi-表型，能在表型，能在p2p2噬菌噬菌体体溶源性溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑4 4 4 4、 -dna-dna重
43、组分子的体外包装：重组分子的体外包装：重组分子的体外包装：重组分子的体外包装：l l-dna-dna重重组组分分子子需需在在体体外外人人工工包包装装成成有有感感染染力力的的噬噬菌菌体体重重组组颗颗粒，方可高效导入受体细胞。粒，方可高效导入受体细胞。用用于于体体外外包包装装的的蛋蛋白白质质可可直直接接从从感感染染了了l l噬噬菌菌体体的的大大肠肠杆杆菌菌中中提提取取，现现已已商商品品化化。这这些些包包装装蛋蛋白白通通常常分分为为相相互互互互补补的的两两部部分分：一一部部分分缺缺少少e e组组份份，另另一一部部分分则则缺缺少少dd组组份份。包包装装时时，当当且且仅仅当当这这两两部部分分包包装装蛋蛋
44、白白与与重重组组l l-dna-dna分分子子混混合合后后，包包装装才才能能有有效效进进行行，任任何何一一种种蛋蛋白白包包装装液液被被重重组组l l-dna-dna污污染染后后，均均不不能能被被包包装装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的5 5 5 5、 -dna-dna及其重组分子的分离纯化：及其重组分子的分离纯化：及其重组分子的分离纯化：及其重组分子的分离纯化：将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期 加入加入l l噬菌体或重组噬菌体或重组l l噬菌体的悬浮液，噬菌体的悬浮液，3
45、737培养培养1 1小时小时 用新鲜培养基稀释，继续培养用新鲜培养基稀释，继续培养4 -124 -12小时。这时噬菌体颗粒小时。这时噬菌体颗粒 密度已达密度已达101013 13 -10-1014 14 / / l l，大肠杆菌细胞已完全裂解大肠杆菌细胞已完全裂解 超速离心，沉淀噬菌体超速离心，沉淀噬菌体 苯酚抽提，释放苯酚抽提，释放l l-dna-dna 乙醇或异丙醇沉淀乙醇或异丙醇沉淀l l-dna-dna 6 6 6 6、 -dna-dna作为载体的优点：作为载体的优点：作为载体的优点：作为载体的优点：l l-dna-dna可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌可在体外包装成噬菌体
46、颗粒，能高效转染大肠杆菌 l l-dna-dna载体的装载能力为载体的装载能力为25 25 kbkb，远远大于质粒的装载量远远大于质粒的装载量重组重组l l-dna-dna分子分子的筛选较为方便的筛选较为方便 重组重组l l-dna-dna分子的提取较为简便分子的提取较为简便 l l-dna-dna载体适合克隆和扩增外源载体适合克隆和扩增外源dnadna片段，但不适合表达片段，但不适合表达 外源基因外源基因（二）大肠杆菌的（二）大肠杆菌的（二）大肠杆菌的（二）大肠杆菌的m13m13单链噬菌体单链噬菌体单链噬菌体单链噬菌体dnadna1 1、m13m13噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性：噬
47、菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性：m13m13噬菌体的外型呈丝状噬菌体的外型呈丝状m13m13 噬菌体噬菌体由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和正正链链dnadna组成组成 致使比其他区域的宿主生长慢致使比其他区域的宿主生长慢, ,形成混浊噬菌斑形成混浊噬菌斑m13 dnam13 dna上上至少有至少有1010个基因个基因27002700个外壳蛋白分子个外壳蛋白分子m13m13 噬菌体噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长不裂解宿主细胞，但抑制其生长 m13m13噬菌体的感染周期噬菌体的感染周期 dna dna（ ）dnadnarfdnarfdnarfdnarfdnarfdnarfdna- d
48、na- dnaiiiivv2 2、m13 dnam13 dna载体的构建载体的构建载体的构建载体的构建iii vi i iv ii x v vii ix viiiiii vi i iv ii x v vii ix viii野生型野生型m13rf-dnam13rf-dnaiii vi i iii vi i iv iv ii ii x v vii ix x v vii ix viiiviiim13mpm13mp系列载体系列载体laczlaczpolylinkerpolylinkermcs所有基因为增殖必需，插入多克隆位点和标记基因所有基因为增殖必需，插入多克隆位点和标记基因3 3、m13 dnam
49、13 dna载体的特点：载体的特点：载体的特点：载体的特点：使克隆的使克隆的dnadna片段以特定单链的形式输出受体细胞外片段以特定单链的形式输出受体细胞外这在这在dnadna定向突变中非常有用定向突变中非常有用m13m13重组分子筛选简便重组分子筛选简便被被m13m13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大斑的混浊度亦越大但但m13-dnam13-dna载体的最大缺陷是装载量小，只有载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 1.5 kbkb（三）病毒载体（三）病毒
50、载体（三）病毒载体（三）病毒载体 与与动植物动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病 毒基因组毒基因组dnadna。 动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类： 单链单链dnadna病毒病毒双链双链dnadna病毒病毒单链单链rnarna病毒病毒双链双链rnarna病毒病毒 rna rna病毒在自我复制时大多存在相应的病毒在自我复制时大多存在相应的dnadna中间反应物，中间反应物，这些这些中
51、间体中间体可作为载体进行常规的可作为载体进行常规的dnadna重组。重组。动物病毒载体动物病毒载体 (1)(1)具有动物病毒的具有动物病毒的复制起始位点复制起始位点 (2) (2)具有在动物细胞中能表达的具有在动物细胞中能表达的选择标记选择标记 (3) (3)具有大肠杆菌具有大肠杆菌质粒载体的复制起始位点、选择标记和多克隆质粒载体的复制起始位点、选择标记和多克隆 位点位点 目目前前常常用用的的基基因因转转移移载载体体有有：(1)(1)猴猴空空泡泡病病毒毒(simian (simian virus virus 4040简简称称sv40)sv40)；(2)(2)腺腺病病毒毒(adenovirus)
52、(adenovirus)；(3)(3)乳乳头头状状病病毒毒(papilloma (papilloma virus)virus)；(4)(4)逆逆转转录录病病毒毒(retrovirus); (retrovirus); (5) (5) 牛牛 痘痘 (vaccinia)(vaccinia)病病 毒毒 ; ; (6) (6) 牛牛 疣疣 病病 毒毒 (bovine (bovine papilloma papilloma virus)virus)等。等。考斯质粒（考斯质粒（考斯质粒（考斯质粒（cosmidcosmid）考斯质粒载体的构建：考斯质粒载体的构建：考斯质粒是一类人工构建的含有考斯质粒是一类人工
53、构建的含有19781978年年collinscollins和和hohnhohn发明构建发明构建phc79phc796400 bp6400 bptctcrrll fragment fragmentcoscosorioriapaprrpstipstibamhibamhisalisalil l-dna -dna coscos序列和序列和质粒复制子的质粒复制子的特殊类型的载体特殊类型的载体coscos site - carrying plasmid site - carrying plasmid1.1.7 7 kbkb的的l l-dna-dna片段片段 pbr322pbr322片段片段装载范围
54、为装载范围为31 - 45 31 - 45 kbkb三、考斯质粒与噬菌粒三、考斯质粒与噬菌粒三、考斯质粒与噬菌粒三、考斯质粒与噬菌粒包装蛋白只识别包装蛋白只识别coscos信号，与信号，与dnadna性质无关性质无关考斯质粒载体的特点：考斯质粒载体的特点：考斯质粒载体的特点：考斯质粒载体的特点：能像能像l l-dna-dna那样进行那样进行体外包装体外包装，并高效转染受体细胞，并高效转染受体细胞 装载量大装载量大（45 45 kbkb）且克隆片段具有一定的大小范围且克隆片段具有一定的大小范围非重组的载体分子不能被包装（包装下限所致）非重组的载体分子不能被包装（包装下限所致）能像质粒那样在受体细
55、胞能像质粒那样在受体细胞中中自主复制自主复制重组操作简便，重组操作简便，筛选容易筛选容易不能体内包装不能体内包装，不裂解，不裂解受体细胞受体细胞噬菌粒（噬菌粒（噬菌粒（噬菌粒（phagemid or phasmidphagemid or phasmid）噬菌粒载体的特点：噬菌粒载体的特点：噬菌粒是一类人工构建的含有噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体单链噬菌体复制起始位点序列复制起始位点序列以及以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体能像能像m13-dnam13-dna那样体外包装，并高效转染受体细胞那样体外包装，并高效转染受体细胞 装载
56、量比常规的装载量比常规的m13mpm13mp系列要大很多系列要大很多（10 10 kbkb）能像质粒那样在受体细胞能像质粒那样在受体细胞中自主复制中自主复制重组操作简便，筛选容易重组操作简便，筛选容易通过克隆双链通过克隆双链dnadna能获得同等长度的能获得同等长度的单一单链单一单链dnadna重要的噬菌粒载体：重要的噬菌粒载体：重要的噬菌粒载体：重要的噬菌粒载体：puc118 / 119puc118 / 119puc118puc118 puc18 puc18 m13m13间隔区间隔区 igigdnadna复制的起始区和包装信号位点复制的起始区和包装信号位点puc119puc119 p
57、uc19 puc19 m13m13间隔区间隔区 igig500 500 个拷贝个拷贝3200 bp3200 bpmcsmcslaczlaczlacilaciorioriapaprrm13-mgm13-mgpuc118 / 119puc118 / 119表示表示m13m13辅助噬菌体辅助噬菌体dnadna滚环复制重要的噬菌粒载体：重要的噬菌粒载体：pbluescript pbluescript （体外转录载体）（体外转录载体）pbluescript = pucpbluescript = puc f1-f1-oriori p pt3t3 p pt7t72958 bp
58、2958 bpmcsmcslaczlaczppt7t7orioriapaprrf1-f1-orioripbluescriptpbluescriptppt3t3噬菌体启动子噬菌体启动子p pt3t3和和p pt7t7强化外强化外源基因的转录源基因的转录提取出来的单链提取出来的单链dnadna重组分子重组分子在噬菌体在噬菌体rnarna聚合酶的存聚合酶的存在下，又可实现外源基因在下，又可实现外源基因的体外转录的体外转录四、人工染色体载体四、人工染色体载体四、人工染色体载体四、人工染色体载体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要需要克隆数百克隆数百甚至上千
59、甚至上千 kb kb 的的dnadna片段，片段， 此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。量也远远不能满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源源dnadna克隆在这些染色体载体上后，组蛋白包装形成克隆在这些染色体载体上后，组蛋白包装形成人工染色体人工染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 目前常用的
60、人造染色体载体包括：目前常用的人造染色体载体包括：细菌人工染色体（细菌人工染色体（bacbac）酵母人工染色体（酵母人工染色体（yacyac）酵母人工染色体（酵母人工染色体（酵母人工染色体（酵母人工染色体（yeast artificial chromosomes, yacyeast artificial chromosomes, yac）yacyac载体应含有下列元件：载体应含有下列元件： 酵母染色体的端粒序列：酵母染色体的端粒序列：teltel pyac4pyac4cen4cen4ecoriecoriura3ura3teltelbamhibamhiteltelorioriapaprrtrp1
61、trp1ars1ars1酵母染色体的复制子酵母染色体的复制子 ：arsars酵母染色体的中心粒序列：酵母染色体的中心粒序列：cencen 酵母系统酵母系统选择标记选择标记：ura3/trp1ura3/trp1大肠杆菌的复制子大肠杆菌的复制子 :ori:ori大肠杆菌的大肠杆菌的选择标记选择标记:ap:apyacyac载体的装载量为载体的装载量为350 - 400 350 - 400 kbkb酵母人工染色体的使用：酵母人工染色体的使用：酵母人工染色体的使用：酵母人工染色体的使用：pyac4pyac4cencenecoriecoriuraurateltelbamhibamhiteltelorior
62、iapaprrtrptrparsarsecoriecoriecoriecoriecoriecoribamhibamhi连接连接转化酵母菌转化酵母菌重组酵母染色体重组酵母染色体易于发生重组、缺乏稳定性、制备工艺繁琐易于发生重组、缺乏稳定性、制备工艺繁琐细菌人工染色体（细菌人工染色体（细菌人工染色体（细菌人工染色体（bacterial artificial chromosomes bacbacterial artificial chromosomes bac）细菌人工染色体通常是在大肠杆菌性因子细菌人工染色体通常是在大肠杆菌性因子f f质粒质粒的基础上的基础上构建的，其装载量范围在构建的，其装载量
63、范围在50 - 30050 - 300 kbkb之间之间各种类型的各种类型的pbacspbacs在大肠杆菌受体菌只能维持在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝单一拷贝pbacspbacs主要适用于：主要适用于：克隆大型基因簇（克隆大型基因簇（gene clustergene cluster）结构结构构建动植物基因文库构建动植物基因文库细菌人工染色体（细菌人工染色体（bacterial artificial bacterial artificial chromosome,bacchromosome,bac） nn优点：能携带大片段优点：能携带大片段dnadna，约，约300kb300kbnn保留了与保
64、留了与f f 因子的自主复制、因子的自主复制、拷贝数控制以及质粒分配等基拷贝数控制以及质粒分配等基本功能相关的基因本功能相关的基因2.1 2.1 用于基因克隆的载体用于基因克隆的载体质粒载体质粒载体噬菌体或病毒载体噬菌体或病毒载体考斯质粒考斯质粒人工染色体载体人工染色体载体几类载体的比较几类载体的比较几类载体的比较几类载体的比较噬菌粒噬菌粒大小大小组成组成导入宿主方式导入宿主方式容量容量用途用途第四次课第四次课第四次课第四次课第二章 分子克隆单元操作2.2 2.3 2.1 克隆载体克隆载体dnadna的体外重组（切与接）的体外重组（切与接）目的基因的克隆目的基因的克隆2.4 基因操作常用技术基
65、因操作常用技术转化与扩增（转与增）转化与扩增（转与增）转化子的筛选与重组子的鉴定（检）转化子的筛选与重组子的鉴定（检）2.5 2.6 基因工程的操作过程基因工程的操作过程基因工程的操作过程基因工程的操作过程切切接接转转增增检检2.2 dna2.2 dna的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）三、其他三、其他用于用于dnadna重组的工具酶重组的工具酶二、二、t4 dnat4 dna链接酶链接酶一、一、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶四、四、dnadna体外体外重组操作重组操作一一限制性内切酶的发现：限制性内切酶的发现：( (宿主细胞的限制和修饰作用宿主
66、细胞的限制和修饰作用) )两两种种不不同同来来源源的的入入- -噬噬菌菌体体 入入k k；入入b b，能能高高频频感感染染各各自自大大肠杆菌宿主细胞（肠杆菌宿主细胞（ k k株株 ，b b 株株 ）。）。当当它它们们分分别别与与其其它它宿宿主主菌菌交交叉叉混混合合培培养养时时，感感染染下下降降数数千千倍倍。一一旦旦入入k k 噬噬菌菌体体在在 b b 株株成成功功，由由 b b 株株繁繁殖殖出出 入入k k 后代，能感染后代，能感染 b b 株株, , 不能感染原来不能感染原来 k k株株. .一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶e coli k株 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体 e coli
67、k株其他 e coli 菌株限制现象限制现象修饰作用修饰作用: :宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物 质和外来遗传物质的目的。二二限制和修饰作用的分子机制限制和修饰作用的分子机制1 1大肠杆菌宿主细胞大肠杆菌宿主细胞 k k株，株，b b 株株 ，有各自的限制和修饰系统。，有各自的限制和修饰系统。1 1）它们均有三个连续的基因位点控制，它们均有三个连续的基因位点控制，hsdr; hsdm; hsds.hsdr; hsdm; hsds.2 2）hsdrhsdr编码限制性核酸内切酶编码限制性核酸内切酶-识别识别dnadna分子特定位点，将双链分子特定位点，将双链dnadna切断。切断。（dn
68、adna分子转化细胞：受体细胞去掉分子转化细胞：受体细胞去掉hsdrhsdr基因位点）基因位点）3 3）hsdmhsdm编码产物是编码产物是dnadna甲基化酶甲基化酶-催化催化dnadna分子特定位点的碱基甲分子特定位点的碱基甲基化反应。基化反应。4 4） hsdshsds表达产物的功能是表达产物的功能是-协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别特殊的作用位点。识别特殊的作用位点。 2.2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 k k株，株，b b株株 中中， 1 1）宿主细胞甲基化酶，将染色体）宿主细胞甲基化酶，将染色体dnadn
69、a和噬菌体和噬菌体dnadna特异性保护特异性保护. . 2 2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。-（修饰）（修饰） 3 3当外来当外来dnadna入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解-（限制）（限制） 4. 4. 由由于于降降解解不不完完全全，外外来来少少数数dnadna分分子子在在宿宿主主细细胞胞中中繁繁殖殖过过程程中中被被宿宿主细胞的主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。 5 5但但丧丧失失在在原原宿宿主主细细胞胞中中的的存存活活能能力力，因因为为接接受受了了新新
70、宿宿主主菌菌甲甲基基化化修修饰饰的的同同时时丧丧失失了了原原宿宿主主菌菌修修饰饰的的标标记记( (一一但但 入入-k -k 噬噬菌菌体体在在 b b 株株成成功，由功，由 b b 株繁殖出株繁殖出 入入-k -k 后代，能感染后代，能感染 b b 株株, , 不能感染原来不能感染原来 k k株株.) .) 6 6细细菌菌利利用用限限制制和和修修饰饰系系统统来来区区分分自自身身dnadna与与外外来来dnadna。c c株株不不能能产产生生限限制制性性内内切切酶酶，其其它它来来源源入入- - 噬噬菌菌体体可可以以感感染染c c株株，而而在在 c c株株繁繁殖殖入入- - 噬菌体则在噬菌体则在 k
71、 k株和株和 b b 株株 受到严格的限制作用受到严格的限制作用 1 1、限制性核酸内切酶的功能与类型、限制性核酸内切酶的功能与类型、限制性核酸内切酶的功能与类型、限制性核酸内切酶的功能与类型细菌的细菌的限制限制与与修饰修饰作用：作用：k/k/ k k株；株；b /b /株株hsd hsd rr：编码限制性核酸内切酶编码限制性核酸内切酶hsd mhsd m：编码限制性甲基化酶编码限制性甲基化酶hsd hsd s s：负责限制性酶和甲基化酶的协同表达负责限制性酶和甲基化酶的协同表达19681968年，年，smithsmith等人首先从等人首先从流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d d株中分离出株中分离出
72、2 2种限切酶：种限切酶：hind iihind ii和和hind iiihind iii 限制外来限制外来dnadna（酶切），（酶切），修饰自身修饰自身dnadna（甲基化保护）（甲基化保护）一、限制性核酸内切酶（一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease restriction endonuclease ) )限制性核酸内切酶的类型（限制性核酸内切酶的类型（限制性核酸内切酶的类型（限制性核酸内切酶的类型（10001000多种）多种）多种）多种）主要特性主要特性主要特性主要特性 i i 型型型型 ii ii 型型型型 （800800多种）多种）多种）多种） ii
73、i iii 型型型型功能功能限切限切/ /修饰修饰 限切限切蛋白结构蛋白结构异源三聚体异源三聚体 单体单体异源二聚体异源二聚体辅助因子辅助因子atp mgatp mg2 2 sam samatp mgatp mg2 2 sam sammgmg2 2 识别序列识别序列tgantgan88tgcttgct旋转对称序列旋转对称序列gagccgagccaacnaacn66gtgcgtgccagcagcagcag切割位点切割位点距识别序列距识别序列1 1kbkb处处识别序列内识别序列内距识别序列下游距识别序列下游24-2624-26bpbp处处用于用于dna重组重组限切限切/ /修饰修饰ii ii型
74、限制性核酸内切酶型限制性核酸内切酶识别序列为识别序列为4-64-6碱基对的回文碱基对的回文对称结构对称结构是是dnadna重组中最常用工具酶重组中最常用工具酶识别、并切割双链识别、并切割双链dnadna分子中分子中特异序列的特异序列的dnadna内切酶。内切酶。单体蛋白、仅有限制性内切单体蛋白、仅有限制性内切酶活性，无甲基化酶活性酶活性，无甲基化酶活性ii ii 型型型型“ “限切酶限切酶限切酶限切酶” ”的识别与切割序列的识别与切割序列的识别与切割序列的识别与切割序列5 5 g c t g c t g a a t t cg a a t t c g a g 3 g a g 33 3 c g a
75、 c g a c t t a a gc t t a a g c t c 5 c t c 5ecor iecor i的识别序列：的识别序列：的识别序列：的识别序列：g / aattcg / aattcecor iecor i的切割位点的切割位点的切割位点的切割位点2 2、ii ii型型型型“ “限切酶限切酶限切酶限切酶” ”的命名的命名的命名的命名属名属名 种名种名 株名株名h i n dh i n d ii ii h i nh i n d d iiiiiih haemophilus aemophilus ininfluenzaefluenzae d d 嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌d d株株同一菌
76、株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶ii ii型限制性核酸内切酶的命名型限制性核酸内切酶的命名型限制性核酸内切酶的命名型限制性核酸内切酶的命名属名属名 种名种名 质粒质粒ecor ecor i i ecor ecor v v e eschericha schericha cocoli li r r 大肠杆菌大肠杆菌r r质粒质粒同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶3 3 3 3、限制性内切酶识别序列的甲基化修饰、限制性内切酶识别序列的甲基化修饰、限制性内切酶识别序列的甲基化修饰、限制性内切酶识别序列的甲基
77、化修饰大肠杆菌中的大肠杆菌中的damdam甲基化酶在甲基化酶在55gatc3gatc3序列中的腺序列中的腺嘌呤嘌呤nn66位位 引入甲基，受其影响的酶有引入甲基，受其影响的酶有bcl ibcl i、mboimboi等，但等，但bamh ibamh i、bgl iibgl ii、sau3a isau3a i不受影响不受影响（提取的质粒）（提取的质粒）（提取的质粒）（提取的质粒） 大肠杆菌中的大肠杆菌中的dcmdcm甲基化酶在甲基化酶在55ccagg3ccagg3或或55cctgg3cctgg3序列序列中的中的胞嘧啶胞嘧啶cc55位位上引入甲基，上引入甲基，受其影响的酶有受其影响的酶有ecor i
78、iecor ii等等哺乳动物中的甲基化酶在哺乳动物中的甲基化酶在55cg3cg3序列中的序列中的cc55位位上引入甲基上引入甲基许多许多类内切酶都有相应的甲基化酶的伙伴，甲基化修类内切酶都有相应的甲基化酶的伙伴，甲基化修饰抑制限切酶活性（前面加饰抑制限切酶活性（前面加m）nn55粘性末端粘性末端nn33粘性末端粘性末端nn平端平端4 4、ii ii 型型型型“ “限切酶限切酶限切酶限切酶” ”的切割产物的切割产物的切割产物的切割产物5335535335353-oh3-oh5-p5-p5-p5-p3-oh3-ohecoriecori等产生的等产生的等产生的等产生的55粘性末端：粘性末端：粘性末端
79、：粘性末端：5 5 gg- -cc- -t t- -g-a-a-t-t-cg-a-a-t-t-c- -gg- -aa- -g 3g 33 3 cc- -gg- -aa- -c-t-t-a-a-gc-t-t-a-a-g- -cc- -t t- -c 5c 5ecori 37 ecori 37 5 5 gg- -cc- -t t- -g-g-ohoh pp-a-a-t-t-c-a-a-t-t-c- -gg- -aa- -g 3g 33 3 cc- -gg- -aa- -c-t-t-a-a-c-t-t-a-a-pp ohoh-g-g- -cc- -t t- -c 5 c 5 退火退火 4-7 4-7
80、 5 5 gg- -cc- -t t- -g a-a-t-t-cg a-a-t-t-c- -gg- -aa- -g 3g 33 3 cc- -gg- -aa- -c-t-t-a-ac-t-t-a-a gg- -cc- -t t- -c 5c 5ohohppohohpppstipsti等产生的等产生的等产生的等产生的33粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端5 5 gg- -cc- -t t- -c-t-g-c-a-gc-t-g-c-a-g- -gg- -aa- -g 3g 33 3 cc- -gg- -aa- -g-a-c-g-t-cg-a-c-g-t-c- -cc- -t t- -c 5c 5ps
81、ti 37 psti 37 5 5 gg- -cc- -t t- -c-t-g-c-a-c-t-g-c-a-ohoh pp-g-g- -gg- -aa- -g 3g 33 3 cc- -gg- -aa- -g-g-pp ohoh-a-c-g-t-c-a-c-g-t-c- -cc- -t t- -c 5 c 5 退火退火 4-7 4-7 5 5 gg- -cc- -t t- -c-t-g-c-ac-t-g-c-a gg- -gg- -aa- -g 3g 33 3 cc- -gg- -aa- -gg a-c-g-t-ca-c-g-t-c- -cc- -t t- -c 5c 5ohohppohohp
82、ppvuiipvuii等产生的等产生的等产生的等产生的平头末端平头末端平头末端平头末端5 5 gg- -cc- -t t- -c-a-g-c-t-gc-a-g-c-t-g- -gg- -aa- -g 3g 33 3 cc- -gg- -aa- -g-t-c-g-a-cg-t-c-g-a-c- -cc- -t t- -c 5c 5pvuii 37 pvuii 37 5 5 gg- -cc- -t t- -c-a-g-c-a-g-ohoh pp-c-t-g-c-t-g- -gg- -aa- -g 3g 33 3 cc- -gg- -aa- -g-t-c-g-t-c-pp ohoh-g-a-c-g-
83、a-c- -cc- -t t- -c 5 c 5 nn同裂酶同裂酶同裂酶同裂酶：识别位点与切割位点均相同的：识别位点与切割位点均相同的：识别位点与切割位点均相同的：识别位点与切割位点均相同的不同来源不同来源不同来源不同来源的酶的酶的酶的酶 hindiii hsui: a hindiii hsui: a / / agcttagcttnn同尾酶同尾酶同尾酶同尾酶：识别位点不同，但切出的：识别位点不同，但切出的：识别位点不同，但切出的：识别位点不同，但切出的片段具有片段具有片段具有片段具有相同相同相同相同 的末端的末端的末端的末端序列序列序列序列 bgliibglii：a a / / gatctga
84、tct bamhi: g bamhi: g / / gatccgatcc 同尾酶的切割产物互为粘性末端，并能连接，但连接后二个酶的同尾酶的切割产物互为粘性末端，并能连接，但连接后二个酶的同尾酶的切割产物互为粘性末端，并能连接，但连接后二个酶的同尾酶的切割产物互为粘性末端，并能连接，但连接后二个酶的识别序列均被破坏。识别序列均被破坏。识别序列均被破坏。识别序列均被破坏。5 5、同裂酶与同尾酶、同裂酶与同尾酶、同裂酶与同尾酶、同裂酶与同尾酶agatcttctagaa gatcttctag aggatcccctaggg gatcccctag g ？ ？ ？ ？ 6 6、“ “限切酶限切酶
85、限切酶限切酶” ”酶活性定义酶活性定义酶活性定义酶活性定义tris-hcltris-hcl50 mm ph 7.550 mm ph 7.5mgclmgcl2210 mm10 mmnaclnacl0 - 150 mm0 - 150 mmdttdtt1 mm1 mmvolumevolume20 - 100 20 - 100 m ml lt tt t37 37 1 - 1.5 1 - 1.5 hrhr1 1 u u 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 1 小时，完全小时，
86、完全小时，完全小时，完全水解水解 1 1 m mg g 标准标准dnadna所需的酶量。所需的酶量。商品酶提供专商品酶提供专用缓冲液用缓冲液7 7 7 7、限切酶的、限切酶的、限切酶的、限切酶的“ “星活性星活性星活性星活性” ” （star activitystar activity）指在高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极指在高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极指在高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极指在高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端端端端phphphph值等不适当条件下，限制性核酸内切酶识别和值等不适当条件下，限制性核酸内切酶识别和值等不适当条件下，限制性核酸内切
87、酶识别和值等不适当条件下，限制性核酸内切酶识别和切割反应特异性下降的现象。切割反应特异性下降的现象。切割反应特异性下降的现象。切割反应特异性下降的现象。例：例：ecor iecor i在正常条件下识别并切割在正常条件下识别并切割55gaattc3gaattc3序列，但序列，但在甘油浓度超过在甘油浓度超过5%5%（v/vv/v）时，也可切割时，也可切割55pupuatpypy3pupuatpypy3或者或者55aatt3 bamh iaatt3 bamh i第五次课第五次课第五次课第五次课8 8、dnadna末端长度对酶活性的影响末端长度对酶活性的影响末端长度对酶活性的影响末端长度对酶活性的影响
88、限制酶切割限制酶切割限制酶切割限制酶切割 dna dna dna dna 时对识别序列两端的时对识别序列两端的时对识别序列两端的时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求非识别序列有长度的要求非识别序列有长度的要求非识别序列有长度的要求，也就是，也就是，也就是，也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。割活性。割活性。割活性。限制酶 待测的寡核苷酸序列待测的寡核苷酸序列2hr20
89、hraccccggtcgaccgg00hindcaagcttgccaagcttggcccaagcttggg00100075ecorggaattcc9090pstgctgcagc tgcactgcagtgcaaactgcag（n）14 ctgcag（n）20 010900010900在设计在设计 pcr pcr 引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切割扩增的割扩增的 pcr pcr 产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。9 9、终止酶切活性的方法、终止酶切活性的
90、方法、终止酶切活性的方法、终止酶切活性的方法1 1、edtaedta2 2、加热、加热、加热、加热3 3、苯酚抽提、苯酚抽提、苯酚抽提、苯酚抽提2.2 dna2.2 dna的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）三、其他三、其他用于用于dnadna重组的工具酶重组的工具酶二、二、t4dnat4dna链接酶链接酶一、一、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶四、四、 dnadna体外体外重组操作重组操作二、二、二、二、 t4 dna t4 dna连接酶连接酶连接酶连接酶 dnadna连接酶的基本性质连接酶的基本性质连接酶的基本性质连接酶的基本性质 a. a. 修
91、复双链修复双链修复双链修复双链dnadna上缺口处的磷酸二酯键上缺口处的磷酸二酯键上缺口处的磷酸二酯键上缺口处的磷酸二酯键dnadna连接酶连接酶5 5 gg- -cc- -t t- -c-t-g-c a gc-t-g-c a g- -gg- -aa- -g 3g 33 3 cc- -gg- -aa- -g a-c-g-t-cg a-c-g-t-c- -cc- -t t- -c 5c 5ohohppohohpp5 5 gg- -cc- -t t- -c-t-g-c-a-gc-t-g-c-a-g- -gg- -aa- -g 3g 33 3 cc- -gg- -aa- -g-a-c-g-t-cg-
92、a-c-g-t-c- -cc- -t t- -c 5c 5nicknicknicknick如：如： 粘性末端粘性末端退火后退火后b. b. 修复修复修复修复rna-dnarna-dna杂合分子中杂合分子中杂合分子中杂合分子中dnadna链上缺口处链上缺口处链上缺口处链上缺口处 的磷酸二酯键的磷酸二酯键的磷酸二酯键的磷酸二酯键t4-dnat4-dna连接酶连接酶5 5 gg- -cc- -uu- -cc- -uu- -gg- -cc- -cc- -gg- -gg- -aa- -gg 3 33 3 cc- -gg- -aa- -gg aa- -cc- -gg- -gg- -cc- -cc- -t
93、t- -c 5c 5ohohppnicknick5 5 gg- -cc- -uu- -cc- -uu- -gg- -cc- -cc- -gg- -gg- -aa- -gg 3 33 3 cc- -gg- -aa- -gg- -aa- -cc- -gg- -gg- -cc- -cc- -t t- -c 5c 5dnadna连接酶的基本性质连接酶的基本性质c. c. 连接多个平头双链连接多个平头双链连接多个平头双链连接多个平头双链dnadna分子：分子：分子：分子：5 5 gg- -cc- -t t- -cc- -aa- -gg- -cc- -t t- -gg- -gg- -aa- -gg 333
94、 3 cc- -gg- -aa- -gg- -t t- -cc- -gg- -aa- -cc- -cc- -t t- -cc 5 55 5 gg- -cc- -t t- -cc- -aa- -gg- -ohoh pp- -cc- -t t- -gg- -gg- -aa- -gg 333 3 cc- -gg- -aa- -gg- -t t- -cc- -pp ohoh- -gg- -aa- -cc- -cc- -t t- -cc 5 5 t4-dnat4-dna连接酶连接酶dnadna连接酶的活性单位定义连接酶的活性单位定义连接酶的活性单位定义连接酶的活性单位定义tris-hcltris-hcl
95、50 - 100 mm ph 7.550 - 100 mm ph 7.5mgclmgcl2210 mm10 mmatpatp0.5 - 1 mm (0.5 - 1 mm (不能大于不能大于1 mm )1 mm )dttdttvolumevolume10 - 20 10 - 20 m ml lt tt t4 - 15 4 - 15 4 - 16 4 - 16 hrhr (37 (37 酶活性最高）酶活性最高）酶活性最高）酶活性最高）1 1 u dnau dna连接酶的酶活性：在最佳反应条件下连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 15 反应反应 1 1 小时，小时，完全连接完全连接 1 1 m m
96、g g l l-dna-dna（hind iiihind iii片段）所需的酶量。片段）所需的酶量。t4 dnat4 dna连接酶的活性单位定义连接酶的活性单位定义连接酶的活性单位定义连接酶的活性单位定义tris-hcltris-hcl50 - 100 mm ph 7.550 - 100 mm ph 7.5mgclmgcl2210 mm10 mmatpatp0.5 - 1 mm (0.5 - 1 mm (不能大于不能大于1 mm )1 mm )dttdttvolumevolume10 - 20 10 - 20 m ml lt tt t4 - 15 4 - 15 4 - 16 4 - 16 hr
97、hr (37 (37 酶活性最高）酶活性最高）酶活性最高）酶活性最高）在在在在 20l 20l 20l 20l 反应体系中于反应体系中于反应体系中于反应体系中于 16161616 ，使，使，使，使 hinhinhinhind d d d 切过的切过的切过的切过的 dna dna dna dna （300g/ml300g/ml300g/ml300g/ml，0.12m 5 0.12m 5 0.12m 5 0.12m 5 末端）在末端）在末端）在末端）在 30 30 30 30 分钟内连接分钟内连接分钟内连接分钟内连接 50% 50% 50% 50% 所需的酶量为所需的酶量为所需的酶量为所需的酶量为
98、 1 1 1 1 个个个个 neb neb neb neb 单位。单位。单位。单位。 此外一般还采用此外一般还采用weissweiss单位，单位，1 weiss1 weiss67 neb67 neb单位单位2.2 dna2.2 dna的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）三、其他三、其他用于用于dnadna重组的工具酶重组的工具酶二、二、t4dnat4dna链接酶链接酶一、一、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶四、四、dnadna体外体外重组操作重组操作1. dna1. dna聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶1 1）大肠杆菌）大肠杆菌）大肠杆菌）大肠杆菌dnad
99、na聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 i i（ dna pol i dna pol i ）5 5 5 5 3333 的的dnadna聚合酶活性聚合酶活性5 5 5 5 3333 的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性3 3 3 3 5555 的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性（未配对的碱基）（未配对的碱基）大肠杆菌大肠杆菌dnadna聚合酶聚合酶 i i的基本性质：的基本性质：3 3 gg- -cc- -t t- -cc- -aa- -gg- -cc- -t t- -gg- -gg- -aa- -gg- -a 5a 55 5 cc- -gg- -aa- -gg- -t t- -ohoh5 5 ppp dnpp
100、p dn（dntp) mgdntp) mg2 2 3 3 gg- -cc- -t t- -cc- -aa- -gg- -cc- -t t- -gg- -gg- -aa- -gg- -a 5a 55 5 cc- -gg- -aa- -gg- -t t- -c-g-a-c-cc-g-a-c-c- -ohohdna pol idna pol i5 5 5 5 3333 的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性nn待切除的核酸分子必须具有待切除的核酸分子必须具有待切除的核酸分子必须具有待切除的核酸分子必须具有5 5 5 5 端磷酸端磷酸端磷酸端磷酸基团基团基团基团nn核苷酸在被切除之前必须是已经核苷酸在被切除
101、之前必须是已经核苷酸在被切除之前必须是已经核苷酸在被切除之前必须是已经配对配对配对配对的的的的nn被切除的核苷酸可以是被切除的核苷酸可以是被切除的核苷酸可以是被切除的核苷酸可以是脱氧脱氧脱氧脱氧的也可以的也可以的也可以的也可以是是是是非脱氧非脱氧非脱氧非脱氧的的的的切口平移标记法切口平移标记法大肠杆菌大肠杆菌dnadna聚合酶聚合酶 i i 的基本用途：的基本用途：5 5 gg- -cc- -t t- -cc- -aa- -gg- -cc- -t t- -gg- -gg- -aa- -gg- -t 3t 33 3 cc- -gg- -aa- -gg- -t t- -cc- -gg- -aa-
102、-cc- -cc- -t t- -cc- -a a 5 5 mgmg2 2 5 5 dntp dntp 5 5 ppppp p da da（ - -3232p-datpp-datp）5 5 gg- -cc- -t t- -c ac a- -gg- -cc- -t t- -gg- -gg- -aa- -gg- -t 3t 33 3 cc- -gg- -aa- -gg- -t t- -cc- -gg- -aa- -cc- -cc- -t t- -cc- -a a 5 5 5 5 gg- -cc- -t t- -cc-a-a-g-g- -cc- -t t- -gg- -gg-a-a- -gg-
103、-t 3t 33 3 cc- -gg- -aa- -gg- -t t- -cc- -gg- -aa- -cc- -cc- -t t- -cc- -a a 5 5 nick translationnick translation制备制备3232p p标记的探针标记的探针dnase idnase idna pol idna pol i采用采用-32p-datp所有的所有的dna聚合酶中只有聚合酶中只有此酶有该反应此酶有该反应缺缺口口平平移移标标记记原原理理2 2 2 2）大肠杆菌）大肠杆菌）大肠杆菌）大肠杆菌dnadnadnadna聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 i i i i 大片段（大片段（大片段（
104、大片段（ klenow klenow klenow klenow ）klenowklenow酶：酶：大肠杆菌大肠杆菌dnadna聚合酶聚合酶i i经枯草杆菌蛋白酶处理，获得经枯草杆菌蛋白酶处理，获得nn端端三分之二的大肽段，即为三分之二的大肽段，即为klenowklenow酶酶klenowklenow酶仍拥有酶仍拥有5 5 5 5 3333 的的dnadna聚合酶活性和聚合酶活性和3 3 3 3 5555 的的核酸外切酶活性，核酸外切酶活性，但失去了但失去了5 5 5 5 3333 的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性大肠杆菌大肠杆菌dnadna聚合酶聚合酶 i i 大片段（大片段（ klenow
105、 klenow ）klenowklenow酶的基本用途：酶的基本用途：酶的基本用途：酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的5 5 粘性末端粘性末端dnadna片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记cdnacdna第二链的合成第二链的合成双脱氧末端终止法测定双脱氧末端终止法测定dnadna序列序列klenowklenow酶的基本用途之一：酶的基本用途之一： 补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的5 5 粘性末端粘性末端5 5 gg- -cc- -t t- -gg- -ohoh pp- -a-a-t-t-ca-a-t-t-c- -gg- -aa- -g 3g 33 3
106、cc- -gg- -aa- -c-t-t-a-ac-t-t-a-a- -pp ohoh- -gg- -cc- -t t- -c 5 c 5 klenowklenowdatp dttpdatp dttp5 5 gg- -cc- -t t- -gg- -aa- -aa- -t t- -t t- -ohoh pp- -a-a-t-t-ca-a-t-t-c- -gg- -aa- -g 3g 33 3 cc- -gg- -aa- -c-t-t-a-ac-t-t-a-a- -pp oh-oh-t t- -t t- -aa- -aa- -gg- -cc- -t t- -c 5 c 5 klenowkleno
107、w酶的基本用途之二：酶的基本用途之二： dnadna片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记5 5 gg- -cc- -t t- -gg- -ohoh pp- -aa- -aa- -t t- -t t- -cc- -gg- -aa- -g 3g 33 3 cc- -gg- -aa- -cc- -t t- -t t- -aa- -aa- -pp ohoh- -gg- -cc- -t t- -c 5 c 5 klenowklenow-3232p-ppp-ppppda dttpda dttp5 5 gg- -cc- -t t- -gg-a-a-a-a-t t- -t t- -ohoh pp- -aa
108、- -aa- -t t- -t t- -cc- -gg- -aa- -g 3g 33 3 cc- -gg- -aa- -cc- -t t- -t t- -aa- -aa- -pp oh-oh-t t- -t t-a-a-a-a-gg- -cc- -t t- -c 5 c 5 3 3）t4-dnat4-dna聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶t4-dnat4-dna酶的基本特性：酶的基本特性：在无在无dntpdntp时，可以从任何时，可以从任何3-3-ohoh端外切端外切在四种在四种dntpdntp均存在时，聚合活性占主导地位均存在时，聚合活性占主导地位5 5 5 5 3333 的的dnadna聚合酶活性
109、和聚合酶活性和3 3 3 3 5555 的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性( (极强极强) )t4-dnat4-dna聚合酶用途之一：聚合酶用途之一：聚合酶用途之一：聚合酶用途之一：切平由核酸内切酶产生的切平由核酸内切酶产生的3 3 粘性末端粘性末端5 5 gg- -cc- -t t- -c-t-g-c-ac-t-g-c-a- -ohoh pp- -gg- -gg- -aa- -g 3g 33 3 cc- -gg- -aa- -gg- -pp hoho- -a-c-g-t-ca-c-g-t-c- -cc- -t t- -c 5 c 5 t4-dnat4-dna聚合酶聚合酶5 5 gg- -cc-
110、 -t t- -cc- - ohoh pp- -gg- -gg- -aa- -g 3g 33 3 cc- -gg- -aa- -gg- -pp hoho - -cc- -cc- -t t- -c 5c 5注意：该酶也能降解双链注意：该酶也能降解双链dnadna，只是其活性比单链降解活性低很多只是其活性比单链降解活性低很多35的核酸外切酶活性 dnadna片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记5 5 gg- -cc- -t t- -cc- -aa- -gg- -cc- -t t- -gg- -gg- -aa- -gg- -t 3t 33 3 cc- -gg- -aa- -gg- -t t- -
111、cc- -gg- -aa- -cc- -cc- -t t- -cc- -a a 5 5 mgmg2 2 5 5 ppp dn ppp dn 5 5 ppppp p da da（ - -3232p-datpp-datp） 5 5 gg- -cc- -t t- -c ac a- -gg- -cc- -t t- -gg- -ohoh ho ho- -t t- -cc- -gg- -aa- -cc- -cc- -t t- -cc- -a a 5 5 t4-dna polt4-dna polt4-dna polt4-dna pol5 5 gg- -cc- -t t- -cc- -aa- -gg- -
112、cc- -t t- -gg- -gg-a-a- -gg- -t t 333 3 cc- -gg-a-a-gg- -t t- -cc- -gg- -aa- -cc- -cc- -t t- -cc- -a a 5 5 t4-dnat4-dna聚合酶用途之二：聚合酶用途之二：聚合酶用途之二：聚合酶用途之二：35的核酸外切酶活性4 4 4 4）依赖于）依赖于）依赖于）依赖于rnarnarnarna的的的的dnadnadnadna聚合酶（反转录酶）聚合酶（反转录酶）聚合酶（反转录酶）聚合酶（反转录酶）反转录酶的基本用途之一：反转录酶的基本用途之一： 以以rnarna为模板合成为模板合成cdnacdna链
113、链3 3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa55mrnamrna反转录酶反转录酶mgmg2 2 dntp dntp5 5tttttttttttt tttttttttttt oligo (dt) oligo (dt) 12-1812-183 3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa55mrnamrna5 5tttttttttttttttttttttttttttt33cdnacdna反转录酶的基本用途之二：反转录酶的基本用途之二：反转录酶的基本用途之二：反转录酶的基本用途之二： 双向外切双向外切双向外切双向外切dna-rnadna-rnadna-rnadna
114、-rna杂合链中的杂合链中的杂合链中的杂合链中的rnarnarnarna链链链链反转录酶反转录酶3 rna3 rna55 dnadna33553 rna3 rna55 dnadna3355反转录酶反转录酶55 dnadna332 2 2 2、核酸酶、核酸酶、核酸酶、核酸酶1 1）单链核酸外切酶：核酸外切酶）单链核酸外切酶：核酸外切酶）单链核酸外切酶：核酸外切酶）单链核酸外切酶：核酸外切酶viivii（exoviiexovii）大肠杆菌的核酸外切酶大肠杆菌的核酸外切酶viivii不需要不需要mgmg2 2 exoviiexovii3355335533553355能够从能够从5 5末端或末端或
115、3 3末端降解末端降解dnadna分子分子, ,底物是底物是单链单链的的dnadna分子分子2 2 2 2）双链核酸外切酶：核酸外切酶）双链核酸外切酶：核酸外切酶）双链核酸外切酶：核酸外切酶）双链核酸外切酶：核酸外切酶 iiiiiiiiiiii（exoiiiexoiiiexoiiiexoiii）exoiiiexoiii33553355mgmg2 2 33553355 大肠杆菌的核酸外切酶大肠杆菌的核酸外切酶 iii iii 特异性地从特异性地从双链的双链的3 3 端端外切而产外切而产生单链区生单链区, ,配合使用配合使用klenowklenow酶酶, ,便可进行放射性标记便可进行放射性标记3
116、3）双链核酸外切酶：）双链核酸外切酶：）双链核酸外切酶：）双链核酸外切酶： 核酸外切酶核酸外切酶核酸外切酶核酸外切酶（ exoexo）l lexoexo33553355mgmg2 2 l l核酸外切酶特异性地从核酸外切酶特异性地从5 5 端端外切外切33553355a、将双链、将双链dna变成单链变成单链dnab、从双链、从双链dna中移去中移去5突出末端突出末端4 4 4 4）单链核酸内切酶：）单链核酸内切酶：）单链核酸内切酶：）单链核酸内切酶：s1s1s1s1核酸酶核酸酶核酸酶核酸酶s1s1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（aspergillus oryz
117、aeaspergillus oryzae）znzn2 2 必需必需最适最适phph范围为范围为4.0 - 4.34.0 - 4.3需要需要nacl 10 - 300 mmnacl 10 - 300 mm降解单链降解单链dnadna的速度比降解双链的速度比降解双链dnadna快快7500075000倍倍降解单链降解单链dnadna的速度比降解单链的速度比降解单链rnarna快快7 7倍倍单链核酸内切酶：单链核酸内切酶：s1s1核酸酶核酸酶s1s1核酸酶的基本反应：核酸酶的基本反应：内切内切单链单链dnadna或或rnarna5 5 gg- -cc- -t t- -cc- -aa- -gg- -c
118、c- -t t- -cc- -t t- -t t- -gg- -aa- -gg- -gg- -aa- -gg- -t 3t 3s1s1znzn2 2 5 5 gg- -cc- -t t- -cc- -aa- -gg- -cc- -t t- -c tc t- -t t- -gg- -aa- -gg- -gg- -aa- -gg- -t 3t 35 5 gg- -cc- -t t- -c ac a- -gg- -cc- -t t- -c tc t- -t t- -gg- -aa- -g gg g- -aa- -gg- -t 3t 35 5 dnmps dnmps 或或 5 5 nmpsnmpss1
119、s1核酸酶的基本用途：核酸酶的基本用途：内切带内切带缺口缺口或或缺刻缺刻的双链的双链dnadna或或rnarna5 5 gg- -cc- -t t- -cc- -aa- -g cg c- -t t- -gg- -gg- -aa- -gg- -t 3t 33 3 cc- -gg- -aa- -gg- -t t- -cc- -gg- -aa- -cc- -cc- -t t- -cc- -a a 5 5 5 5 gg- -cc- -t t- -cc- -aa- -gg- -cc- -t t- -gg- -gg- -aa- -gg- -t 3t 33 3 cc- -gg- -aa- -gg- -t t
120、- -cc aa- -cc- -cc- -t t- -cc- -a a 5 5 nicknickgapgaps1s1znzn2 2 5 5 gg- -cc- -t t- -cc- -aa- -gg3 3 cc- -gg- -aa- -gg- -t t- -cct t- -gg- -gg- -aa- -gg- -t 3t 3aa- -cc- -cc- -t t- -cc- -a a 5 5 1）3端外切酶活性端外切酶活性 2）5端外切和内切活性。端外切和内切活性。 作用：作用： 1）从双链）从双链dna两端连续降解两端连续降解 2）单链）单链dna外切和内切外切和内切 3）超螺旋结构的线性化）超
121、螺旋结构的线性化 4） 在分子克隆中可控制性截短在分子克隆中可控制性截短dna分子分子5 5）bal31bal31核酸酶核酸酶核酸酶核酸酶bal31bal31核酸酶的基本用途：诱发核酸酶的基本用途：诱发dnadna缺失缺失突变突变ecoriecoriaabbccecoriecoriecoriecoribbccaabal31bal31bbccaa环化环化aacc3 3 3 3、核酸修饰酶、核酸修饰酶、核酸修饰酶、核酸修饰酶1 1）末端脱氧核苷酰转移酶（）末端脱氧核苷酰转移酶（tdttdt）tdttdt的基本特性：来自小牛胸腺的基本特性：来自小牛胸腺不需要模板的不需要模板的dnadna聚合酶，聚合
122、酶，随机掺入随机掺入dntpsdntps5 p3 hooh 3 p 5 tdttdtmgmg2 2 datp datp5 p3 hoaaaaaaaaaaaa oh 3 p 5 tdttdt的基本特性：的基本特性：5 p3 hooh 3 p 5 tdttdtcoco2 2 datp datp5 p3 ho aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa oh 3 p 5 5 p3 hooh 3 p 5 tdttdtcoco2 2 datp datp5 p3 hoaaaaaaaaaaaaaa oh 3 p 5 aaaaaaaaaaa2 2 2 2）碱性磷酸单酯酶）碱性磷酸单酯酶）碱性磷酸单酯酶）
123、碱性磷酸单酯酶来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（cipcip） 5050来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（bapbap）5 poh 3 dna or rna5 ppp dn5 pppnbap / cipbap / cipoh 3 5 ho5 ho dn5 ho n可可以以有有效效防防止止载载体体自自身身环环化化3 3 3 3）t4-t4-t4-t4-多核苷酸磷酸激酶（多核苷酸磷酸激酶（多核苷酸磷酸激酶（多核苷酸磷酸激酶（t4-pnpt4-pnpt4-pnpt4-pnp）t4-pnpt4-pnp的基本特性：在的基本特性：在dnadna、rnar
124、na的的5-5-ohoh上加磷上加磷5 ho3 hooh 3 oh 5 t4-pnpt4-pnpmgmg2 2 p pppatpppatp（g g- -3232p-atpp-atp）5 p3 hooh 3 p 5 用于探针的末端同位素标记：用于探针的末端同位素标记：2.2 dna2.2 dna的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）的体外重组（切、接）三、其他三、其他用于用于dnadna重组的工具酶重组的工具酶二、二、t4dnat4dna链接酶链接酶一、一、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶四、四、dnadna体外体外重组操作重组操作四、四、dnadna体外重组操作体外重组
125、操作提高重组率的策略提高重组率的策略dnadna酶切片段的连接策略酶切片段的连接策略dnadna的酶切操作策略的酶切操作策略1 1、dnadna酶切组合策略与操作酶切组合策略与操作酶切组合策略与操作酶切组合策略与操作尽量采用双酶切片段重组尽量采用双酶切片段重组 （基因插入方向确定）（基因插入方向确定）尽量不要采用多克隆位点中紧邻的酶尽量不要采用多克隆位点中紧邻的酶 不能采用外源基因内部有切点的酶不能采用外源基因内部有切点的酶尽量采用同盐浓度要求的酶组合尽量采用同盐浓度要求的酶组合尽量采用常用酶组合尽量采用常用酶组合尽量通过尽量通过pcrpcr引物设计优引物设计优 化酶切组合化酶切组合1 1）限
126、切酶的盐浓度要求与操作）限切酶的盐浓度要求与操作）限切酶的盐浓度要求与操作）限切酶的盐浓度要求与操作低盐酶：低盐酶：0 - 50 mm0 - 50 mm中盐酶：中盐酶：100 mm100 mm高盐酶：高盐酶：150 mm150 mm限切酶活性对盐浓度高度敏感，据盐浓度要求分三类：多酶联合酶解时的策略多酶联合酶解时的策略多酶联合酶解时的策略多酶联合酶解时的策略a a a a、对盐浓度要求相同的酶可以同时酶切、对盐浓度要求相同的酶可以同时酶切、对盐浓度要求相同的酶可以同时酶切、对盐浓度要求相同的酶可以同时酶切5 5 gctacatgctacatggatcccgggggatcccgggttcgcat
127、3ttcgcat33 3 cgatgtacgatgtacctagggccccctagggcccaagcgta5aagcgta5bamhi smaibamhi smai5 5 gctacatgctacatg g gatcccggggatcccgggttcgcat3 ttcgcat3 3 3 cgatgtacgatgtacctag cctag ggcccggcccaagcgta5aagcgta55 5 gctacatgctacatggatcccggatccc ggggggttcgcat3ttcgcat33 3 cgatgtacgatgtacctagggcctaggg ccccccaagcgta5a
128、agcgta5但应注意：紧密但应注意：紧密相连时难切割相连时难切割b b、对盐浓度要求不同的酶，可采取下列策略：、对盐浓度要求不同的酶，可采取下列策略：、对盐浓度要求不同的酶，可采取下列策略：、对盐浓度要求不同的酶，可采取下列策略：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切0.10.1倍体积的倍体积的 5 5 m naac ph 5.4m naac ph 5.42.52.5倍体积的冰冷乙醇倍体积
129、的冰冷乙醇冰浴冰浴 5 5 分钟、高速冷冻离心分钟、高速冷冻离心1010分钟、干燥分钟、干燥2 2 2 2）dnadnadnadna样品纯度要求与操作样品纯度要求与操作样品纯度要求与操作样品纯度要求与操作待酶切待酶切待酶切待酶切dnadna样品必须达到较高纯度，样品中的蛋白质、苯样品必须达到较高纯度，样品中的蛋白质、苯样品必须达到较高纯度，样品中的蛋白质、苯样品必须达到较高纯度，样品中的蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、酚、氯仿、乙醇、酚、氯仿、乙醇、酚、氯仿、乙醇、edtaedta、sdssds、naclnacl等杂质过多抑制酶等杂质过多抑制酶等杂质过多抑制酶等杂质过多抑制酶活性。活性。活性。活性。
130、策略：策略：策略：策略：加大酶的用量加大酶的用量加大反应总体积加大反应总体积延长反应时间延长反应时间3 3 3 3）dnadnadnadna局部酶切消化局部酶切消化局部酶切消化局部酶切消化nn在基因文库构建中具有重要意义在基因文库构建中具有重要意义在基因文库构建中具有重要意义在基因文库构建中具有重要意义nndnadnadnadna分子中分子中分子中分子中只有只有只有只有部分限制位点被内切酶所切割而产生不完部分限制位点被内切酶所切割而产生不完部分限制位点被内切酶所切割而产生不完部分限制位点被内切酶所切割而产生不完全消化的产物全消化的产物全消化的产物全消化的产物nn可以通过可以通过可以通过可以通过
131、缩短缩短缩短缩短酶切消化酶切消化酶切消化酶切消化反应的时间，降低反应的时间，降低反应的时间，降低反应的时间，降低反应的反应的反应的反应的温度温度温度温度，减少酶用量减少酶用量减少酶用量减少酶用量来达到局部消化的目的来达到局部消化的目的来达到局部消化的目的来达到局部消化的目的. . . .2 2、dnadna连接策略与操作连接策略与操作一粘一平末端的连接（简单）一粘一平末端的连接（简单）单酶切粘性末端的连接单酶切粘性末端的连接双酶切粘性末端的连接（简单）双酶切粘性末端的连接（简单） 平端的连接平端的连接 不匹配末端的连接不匹配末端的连接1 1）单酶切粘性末端的连接：）单酶切粘性末端的连接：载体载
132、体载体载体55端用碱性磷酸酯酶去磷端用碱性磷酸酯酶去磷端用碱性磷酸酯酶去磷端用碱性磷酸酯酶去磷 酸化防自环酸化防自环酸化防自环酸化防自环5 5gaattccttaaggaattccttaagecoriecori5gcttaaaattcg5 5 gcttaa 55 aattcg5 退火退火gcttaaaattcg5 gcttaa 5 aattcggcttaaaattcg5 gcttaa 5 aattcgt4-dna ligaset4-dna ligasegaattccttaag5 5gaattccttaaggaattccttaag5 5gaattccttaag外源片段外源片段有有2 2个插入个插
133、入方向方向外源片段外源片段载体载体2 2）同尾酶生产的粘性末端的连接）同尾酶生产的粘性末端的连接bamhibamhi5 5ggatcccctaggggatcccctagg5gcctaggatccg5 5 tactag 55 gatcat5 退火退火gcctaggatccg5 tactag 5 gatcatt4-dna ligaset4-dna ligasetgatccactagg5 5ggatcacctagt5 tgatcaactagt5 bgliibgliigcctaggatccg5 tactag 5 gatcattgatccactagg5 5ggatcacctagt外源片段外源片段有有2
134、2个插入个插入方向方向2 2个酶切个酶切位点消失位点消失3 3）平端的连接）平端的连接）平端的连接）平端的连接从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多接，因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包括：提高平头末端连接效率的方法包括： 加大连接酶用量（加大连接酶用量（1010倍大于粘性末端的连接）倍大于粘性末端的连接） 加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加大平头末端底物
135、的浓度，增加分子间碰撞机会 加入加入10% 10% peg8000peg8000，促进大分子之间的有效作用促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（加入单价阳离子（naclnacl），），最终浓度最终浓度150-200 150-200 mmmm4 4）不同粘性末端的连接：）不同粘性末端的连接：补平与切平补平与切平bamhibamhi5 5ggatcccctaggggatcccctagg5gcctaggatccg5 5 ctgcag5 gacgtc3 t4-dna ligaset4-dna ligasecgatccgctagg5 5ggatcgcctagc5 ctgcaggacgtc5 psti
136、psti3 t4-dna polt4-dna pol切平切平5 cg5 gcklenowklenow补平补平5ggatccctaggatcc5 ctaggcgatccgctagg5 5ggatcgcctagc5gcctaggatccg5 5 gcttaa 555 aattcgt4-dna ligaset4-dna ligase5 5klenowklenow补平补平klenowklenow补平补平5ggatccctaggatcc5 ctagg5 gaattcttaa 555 aattcttaagtdttdttdttdtdgtpdgtpdctpdctpgaattggggggcttaa aattcg
137、gggggttaagggatccccccccctaggatccccccccctagggaattgggggggatcccttaaccccccctaggggatcccccccaattccctagggggggttaag5 5gaattgggggggatcccttaaccccccctaggggatcccccccaattccctagggggggttaag退火退火bamhbamh iibamhbamh iiecor iecor ibamh ibamh i5 5）不同粘性末端的连接：）不同粘性末端的连接：（55突出末端）突出末端）ctgca 3 gg3 acgtc5 gcatg 3c5c3 gtacgt4-
138、dna ligaset4-dna ligasetdttdttdttdtdctpdctpdgtpdgtpgcatgcccccc 3c退火退火pst ipst ipst ipst ic3 ccccccgtacgctgcagggggg 3 gg3 ggggggacgtc5 5gcatgcccccc gc ggggggacgtcctgcagggggg cg ccccccgtacg5 5gcatgcccccc gc ggggggacgtcctgcagggggg cg ccccccgtacg5 5gcatgcccccctgcagcgtacggggggacgtcctgcaggggggcatgcgacgtcc
139、ccccgtacg5 5gcatgcccccctgcagcgtacggggggacgtcctgcaggggggcatgcgacgtccccccgtacgklenowklenowpst ipst isph isph i5 5）不同粘性末端的连接：）不同粘性末端的连接：（33突出末端）突出末端）6 6）酶切位点的更换（加装人工接头）酶切位点的更换（加装人工接头）bamhibamhi5 5ggatcccctaggt4-dna ligaset4-dna ligaseklenowklenow补平补平gatcc5 g5gcctag55 5ggatccctag5 gatccctagg55ggatcggaat
140、tccgatcccctagccttaaggctagg5 5ecor iecor iggaattccccttaaggecor i linkerecor i linkerbamhi的位点已被破坏3 3、提高重组率的策略、提高重组率的策略重组率的定义重组率的定义 重组率重组率 = = 含有外源含有外源dnadna的重组分子数的重组分子数 / / 载体分子总数载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75% - 75% 重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以 大大简化大大简化dnadna重组
141、的后续操作。重组的后续操作。提高重组率的策略提高重组率的策略1 1）提高外源）提高外源dnadna片段与载体的分子比片段与载体的分子比：5 5 : : 1 1 - - 10 10 : : 1 1 2 2）载体）载体dnadna分子在连接前先除去磷酸基团：分子在连接前先除去磷酸基团： 5 5gaattccttaaggaattccttaagecoriecori5gcttaa paattcg5 p5 gcttaa oh 55 aattcg5 ho退火退火5 g-a-a-t-t-cc-t-t-a-a g5g a-a-t-t-cc-t-t-a-a-gohhoohho碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单
142、酯酶碱性磷酸单酯酶特别针对单酶切连接3 3）加装同聚尾末端：）加装同聚尾末端： ctgca 3 gg3 acgtc5 gcatg 3c5c3 gtacgt4-dna ligaset4-dna ligasetdttdttdttdtdctpdctpdgtpdgtpgcatgcccccc 3c退火退火c3 ccccccgtacgctgcagggggg 3 gg3 ggggggacgtc5 5gcatgcccccc gc ggggggacgtcctgcagggggg cg ccccccgtacg5 5gcatgcccccctgcagcgtacggggggacgtcctgcaggggggcatgcgac
143、gtccccccgtacgklenowklenow第二章 分子克隆单元操作2.2 2.3 2.1 克隆载体克隆载体dnadna的体外重组（切与接）的体外重组（切与接）目的基因的克隆目的基因的克隆2.4 基因操作常用技术基因操作常用技术转化与扩增（转与增）转化与扩增（转与增）转化子的筛选与重组子的鉴定（检）转化子的筛选与重组子的鉴定（检）2.5 2.6 基因工程的操作过程基因工程的操作过程基因工程的操作过程基因工程的操作过程切切接接转转增增检检一、用于基因转移的受体（宿主）一、用于基因转移的受体（宿主） 二、转化与扩增二、转化与扩增2.3 2.3 转化与扩增转化与扩增转化与扩增转化与扩增一、用于
144、基因转移的受体（宿主）一、用于基因转移的受体（宿主）受体（宿主）应具备的条件受体（宿主）应具备的条件各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性实验室常用的基因工程受体实验室常用的基因工程受体1 1、受体（宿主）应具备的条件、受体（宿主）应具备的条件限制性缺陷型限制性缺陷型外切酶和内切酶活性缺陷（外切酶和内切酶活性缺陷（hsdrhsdr- -） nn重组整合缺陷型重组整合缺陷型（防止同源重组）（防止同源重组）用于基因扩增或高效表达的受体细胞用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recareca- - ， recbrecb- -，reccrecc- - ） 具有较高的转化效率具有较高的转化效率具有与
145、载体选择标记互补的表型具有与载体选择标记互补的表型感染寄生缺陷型感染寄生缺陷型防止重组细菌扩散污染，生物武器除外防止重组细菌扩散污染，生物武器除外 基因工程主要宿主系统 原核细胞原核细胞(prokaryotic)真菌（真菌（fungus ) 昆虫昆虫(baculovirus ) 高等真核细胞（高等真核细胞（eukaryotic)人（基因治疗）人（基因治疗）动、植物（基因农场）动、植物（基因农场）2 2、各种基因工程受体（宿主）的特性、各种基因工程受体（宿主）的特性1 1）大肠杆菌）大肠杆菌 遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组
146、子稳定。单，重组子稳定。 适用于外源适用于外源dnadna的扩增和克隆、基因文库的构建和外源基的扩增和克隆、基因文库的构建和外源基因的高效表达，是因的高效表达，是dnadna重组实验和基因工程的主要受体菌。重组实验和基因工程的主要受体菌。 产生结构复杂、种类繁多的内毒素。产生结构复杂、种类繁多的内毒素。各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性2 2）枯草芽孢杆菌）枯草芽孢杆菌 遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全 ，生长迅速，培，生长迅速，培养简单，不产内毒素养简单，不产内毒素 适用于重组蛋白与多肽、特别是微生物来源的酶的高效适用于重组蛋白与多肽、特别是微生物来
147、源的酶的高效分泌表达分泌表达。各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性3 3）链霉菌）链霉菌抗生素的主要生产者，相对操作简便，不产内毒素抗生素的主要生产者，相对操作简便，不产内毒素主要用于主要用于抗生素生产菌株抗生素生产菌株的改良的改良遗传不稳定，生长相对缓慢遗传不稳定，生长相对缓慢各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性4 4）酵母菌）酵母菌 具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定（糖基化、翻译后修饰）外源基因表达系统完善，遗传稳定（糖基化、翻译后修饰） 适用于外源适用于外源dnadn
148、a的扩增、克隆以及真核生物基因的高效的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是dnadna重组实验和基因工程重要的真核性受体菌重组实验和基因工程重要的真核性受体菌 内源性蛋白产物种类繁多且含量高内源性蛋白产物种类繁多且含量高各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性5 5）昆虫细胞（家蚕，杆状病毒表达系统）昆虫细胞（家蚕，杆状病毒表达系统） 具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定快，培养成本低廉，遗传稳定 适用于真
149、核生物基因的高效表达适用于真核生物基因的高效表达 dnadna重组操作系统欠完善重组操作系统欠完善各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性6 6）哺乳动物细胞（中国）哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞仓鼠卵巢细胞 chocho） 与人的亲缘关系近，表达系统完善，具有合适的糖基化与人的亲缘关系近，表达系统完善，具有合适的糖基化修饰系统修饰系统 适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是的生产，是dnadna重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体 细胞培养条件苛刻，生长缓慢细胞培养条件苛刻，生长缓慢
150、各种基因工程受体的特性各种基因工程受体的特性7 7）植物细胞（拟南芥菜、烟叶）植物细胞（拟南芥菜、烟叶） 农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用胞培养简单且成本低廉，具有光合作用 适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良农作物品质的改良 遗传操作繁琐遗传操作繁琐 3 3、实验室常用的基因工程受体（宿主）、实验室常用的基因工程受体（宿主）大肠杆菌大肠杆菌用于接受质粒：用于接受质粒：c600c600、w3110w3110、hb101
151、hb101、jm83jm83、 jm101jm101（apapss、tctcss、cmcmss） 用于接受用于接受l l-dna-dna：le392le392、ed8654ed8654 真菌真菌哺乳动物细胞哺乳动物细胞 cho cho 毕赤酵母、汉森酵母、毕赤酵母、汉森酵母、 啤酒酵母啤酒酵母酵母菌：酵母菌：丝状真菌：丝状真菌：黑曲霉、青霉黑曲霉、青霉二、二、转化和扩增（转与增）转化和扩增（转与增）转化的原理与技术转化的原理与技术转化率转化率转化细胞的扩增转化细胞的扩增几个基本概念几个基本概念感受态（感受态（compentent )compentent )：受体受体( (宿主）细胞经过一些理化
152、或生物学方法处理后，细胞膜宿主）细胞经过一些理化或生物学方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性的改变，成为能允许外源的通透性发生暂时性的改变，成为能允许外源dnadna进入的一进入的一种生理状态。种生理状态。感受态细胞（感受态细胞（compentent cell )compentent cell )转化（转化（transformation )transformation )：外源外源dnadna导入特定受体（宿主）细胞，并使之繁殖和表达的操作。导入特定受体（宿主）细胞，并使之繁殖和表达的操作。转化子（转化子（transformant)transformant)：经转化而带有外源经转化而带有外源d
153、nadna的受体（宿主）细胞。的受体（宿主）细胞。重组子（重组子（recombinant)recombinant)：含有重组含有重组dnadna的转化子。的转化子。相对于仅含空载体的转化子而言相对于仅含空载体的转化子而言。1 1、转化的原理与技术、转化的原理与技术caca2 2 诱导的完整细菌细胞的转化（诱导的完整细菌细胞的转化（caca2 2 法）法）细菌原生质体的转化（原生质体法）细菌原生质体的转化（原生质体法）完整细菌细胞的完整细菌细胞的电穿孔转化（电转化法）电穿孔转化（电转化法）l l噬菌体噬菌体dnadna的转染的转染1 1）caca2 2 诱导的完整细菌细胞的转化诱导的完整细菌细胞
154、的转化诱导的完整细菌细胞的转化诱导的完整细菌细胞的转化 ca ca2 2 诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），大肠杆菌等），19701970年建立此技术，其原理是年建立此技术，其原理是caca2 2 与细菌外与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态即为使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态即为感受态感受态 。（mgcl2 稳定稳定dna）大肠杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞的制备：的制备：100 100 ml ml 菌体
155、培养至菌体培养至odod600 600 = 0.5= 0.5，离心收集菌体离心收集菌体 用用10 10 ml ml 冰冷的冰冷的10 10 mmmm caclcacl22溶液悬浮菌体，离心溶液悬浮菌体，离心用用1 1 ml ml 冰冷的冰冷的75 75 mmmm caclcacl22溶液悬浮菌体溶液悬浮菌体 冰浴放置冰浴放置12 - 2412 - 24小时，备用小时，备用 收集菌体收集菌体大肠杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：的质粒转化：取取100 100 m ml l 感受态细胞，加入相当于感受态细胞，加入相当于50 50 ng ng 载体的重载体的重组组冰浴放置半小时冰浴放置半小
156、时 在在4242保温保温 9090秒（热脉冲）秒（热脉冲） 快速将转化细胞转移至冰浴中放置快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 - 21 - 2分钟分钟 dnadna连接液，混匀连接液，混匀加入加入1 1 ml ml 新鲜培养基，新鲜培养基，于于3737培养培养 1 1 小时（扩增）小时（扩增） 涂在合适的固体培养基平板上进行筛选涂在合适的固体培养基平板上进行筛选 2 2）细菌原生质体的转化）细菌原生质体的转化 革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源dnadna的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞的主要屏障是细胞壁，因而这类细
157、菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组dnadna分子分子 酵母菌、霉菌、植物细胞也可用酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化原生质体法进行转化 不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以细菌需生长在高渗培养基中（如的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持终悬浮在蔗糖等
158、渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂无水无去污剂 细菌原生质体细菌原生质体的制备：的制备： 取取0.2 - 10.2 - 1mlml的原生质体悬浮液（的原生质体悬浮液（10108 88 8-10-109 99 9个原生质体），加个原生质体），加入入10 - 20 10 - 20 m ml dnal dna重组连接液，同时加入含有重组连接液，同时加入含有peg1000peg1000和和caca2 2 的等渗溶液，混匀的等渗溶液，混匀 细菌原生质体细菌原生质体的转化的转化：细菌原生质体细菌原生质体的再生的再生： 原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生原生质体再生的主要目
159、的是使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素 3 3）电穿孔转化）电穿孔转化 将将待待转转化化的的质质粒粒或或dnadna重重组组连连接接液液加加在在电电穿穿孔孔转转化化仪仪的的样样品品池池中中，两两极极施施加加高高压压电电场场。在在强强大大电电场场的的作作用用下下，细细菌菌细细胞胞壁壁和和细胞膜产生缝隙，质粒或细胞膜产生缝隙，质粒或dnadna重组分子便可进入细胞内重组分子便可进入细胞内 电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率
160、差别很大体细胞均有效，但转化效率差别很大 同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验4 4）l l噬菌体噬菌体dnadna的转染的转染感受态细胞的培养：感受态细胞的培养： 将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和mgclmgcl22的培养基的培养基 中培养至中培养至odod600 600 = 0.5= 0.5体外包装：体外包装： 加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，3030保温保温1010分钟分钟筛选：筛选： 将噬菌体颗粒适当稀释后，与对数生长期的大肠杆菌受体细将噬菌体颗粒适当稀释后，
161、与对数生长期的大肠杆菌受体细胞混合，然后涂板筛选。胞混合，然后涂板筛选。2 2、转化率、转化率转化率的定义转化率的定义 每微克每微克dnadna分子转化宿主菌能获得的转化子数。分子转化宿主菌能获得的转化子数。例例如如，puc18puc18对对大大肠肠杆杆菌菌的的转转化化率率为为101088，即即每每微微克克puc18puc18中中只只有有101088个个分分子子能能进进入入受受体体细细胞胞。一一微微克克puc18puc18共共有有3.43.4x10x101111个个分分子子（6.026.02x10x1017 17 / / 2686x6602686x660），也也就就是是说说，每每3400340
162、0个个puc18puc18分分子子才才有有一一个分子进入受体细胞个分子进入受体细胞 另另一一方方面面，在在实实际际操操作作过过程程中中，转转化化一一微微克克puc18puc18共共需需2 2mlml感感受受态态细细胞胞，大大约约含含有有2 2x10x101010个个大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞，也也就就是是说说，每每200200个细胞只有一个细胞能接纳个细胞只有一个细胞能接纳puc18 dnapuc18 dna 转化率的用途转化率的用途 利用转化率和重组率等参数可以帮助设计利用转化率和重组率等参数可以帮助设计dnadna重组实验规模重组实验规模例如，例如，某一某一dnadna重组实验的重组率为重组
163、实验的重组率为20 %，转化率为，转化率为101077/ /m mg g载体，载体， 经切接处理后的载体转化率比天然的载体低经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100100倍，欲获得倍，欲获得10104 44 4个个 重组克隆，需投入多少载体重组克隆，需投入多少载体dnadna进行重组实验？进行重组实验？ 若重组率为若重组率为1000%，则转化后产生，则转化后产生101044个重组克隆需要：个重组克隆需要： 10 1044 / 10 / 1077 x 10 x 10 - 2- 2 = 0.1 = 0.1 m mg g 载体载体dnadna 考虑到实验系统的重组率为考虑到实验系统的重
164、组率为20 %，所以实际投入载体应为：，所以实际投入载体应为： 0.1 / 20% = 0.50.1 / 20% = 0.5 m mg g 载体载体dnadna 载体投入量确定后，外源载体投入量确定后，外源dnadna的投入量即可按的投入量即可按1010 1 1的要求算的要求算出（出（5 5 m mg g），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选 转化率的影响因素转化率的影响因素载体及载体及dnadna重组分子方面：重组分子方面： 载体本身的性质：载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不
165、同 载体的空间构象：载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级超螺旋质粒低两个数量级 插入片段的大小：插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低 转化率的影响因素转化率的影响因素受体细胞方面：受体细胞方面： 受体细胞必须与载体相匹配，例如：受体细胞必须与载体相匹配，例如：pbr322pbr322转化大转化大肠杆菌肠杆菌jm83jm83株，转化率很低；但
166、对大肠杆菌株，转化率很低；但对大肠杆菌ed8767ed8767株的株的转化率则较高转化率则较高 转化方法方面：转化方法方面： 受体细胞的预处理：受体细胞的预处理：影响最大影响最大供受体的比例：供受体的比例：caca2 2 诱导转化诱导转化 0.1 0.1 ml ml 感受态感受态细胞细胞 50 50 ng dnang dna 转化方法：转化方法：caca2 2 诱导转化诱导转化 101066 - 10 - 1077 / / m mg g dnadna 原生质体转化原生质体转化 101099 个个原生质体原生质体 50 50 ng dnang dna 原生质体转化原生质体转化 101055 -
167、10 - 1066 / / m mg dnag dna l l-dna-dna转染转染 101077 - 10 - 1088 / / m mg g dnadna 电穿孔转化电穿孔转化 101066 - 10 - 1099 / / m mg dnag dna 3 3、转化细胞的扩增、转化细胞的扩增扩增操作扩增操作 转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如： caca2 2 诱导转化后的诱导转化后的3737培养一个小时培养一个小时 原生质体转
168、化后的再生过程原生质体转化后的再生过程 l l噬菌体转染后的噬菌体转染后的3030培养等，均属扩增操作培养等，均属扩增操作 扩增操作的目的扩增操作的目的增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序 使载体分子上的标记基因扩增和表达，便于筛选使载体分子上的标记基因扩增和表达，便于筛选 表达外源基因，便于筛选和鉴定表达外源基因，便于筛选和鉴定 第二章 分子克隆单元操作2.2 2.3 2.1 克隆载体克隆载体dnadna的体外重组（切与接）的体外重组（切与接）目的基因的克隆目的基因的克隆2.4 基因操作常用技术基因操作常用技术转化与扩增（转与增
169、）转化与扩增（转与增）转化子的筛选与重组子的鉴定（检）转化子的筛选与重组子的鉴定（检）2.5 2.6 基因工程的操作过程基因工程的操作过程基因工程的操作过程基因工程的操作过程切切接接转转增增检检转化子的筛选和鉴定的必要性转化子的筛选和鉴定的必要性 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分助各种筛选和鉴定方法区分转化子转化子与非转化子与非转化子、重组子重组子与非与非重组子、重组子、目的重组子目的重组子与非目的重组子与非目的重组子转化子转化子重组子重组子目的重组子目的重组子转化子筛选和鉴定流程转化子筛选和鉴定流程 1
170、1、筛选、筛选选择性平板选择性平板筛选筛选 转化子转化子重组子重组子目的重组子目的重组子非转化子非转化子2 2、重组子初步鉴定、重组子初步鉴定显色、显色、pcrpcr、比大小、比大小、酶切、分子杂交、酶切、分子杂交、生物生物/ /免疫学活性免疫学活性 3 3、重组子确证、重组子确证 dnadna序列分析序列分析 4 4、外源基因表达产物检测、外源基因表达产物检测 仅当外源基因克隆于特定表达载体和仅当外源基因克隆于特定表达载体和宿主中时才需要。常规基因克隆则否。宿主中时才需要。常规基因克隆则否。1 1、抗药性筛选法、抗药性筛选法roproisal ibamh itcrpvu ipst ipst
171、iecor icla ihind iiihind iibal iapr绝大多数载体的抗性标记用于筛选转化子，绝大多数载体的抗性标记用于筛选转化子，但但pbr322pbr322可筛选重组子：可筛选重组子： pbr3224363 bpori可区分可区分转化子转化子与非转化子、与非转化子、重组重组子子与非重组子与非重组子将外源将外源dnadna片段插在片段插在pst ipst i位点：位点： 非重组子呈非重组子呈 apaprr、tctcrr重组子呈重组子呈 apapss、tctcr r 将外源将外源dnadna片段插在片段插在bamhibamhi位点：位点： 非重组子呈非重组子呈 apaprr、tc
172、tcr r 重组子呈重组子呈 apaprr、tctcs s 一、转化子筛选（利用载体选择标记）一、转化子筛选（利用载体选择标记）双抗药性标记筛选法的基本操作双抗药性标记筛选法的基本操作 先将转化液涂布含有先将转化液涂布含有apap的平板的平板再将再将apap平板上的转化子影印至平板上的转化子影印至含有含有apap和和tctc的平板上的平板上 在在apap平板上生长、但在平板上生长、但在apap和和tctc平板上平板上不长的转化子即为不长的转化子即为 apapap tcap tc影印影印对照对照挑选挑选重组子重组子 2 2、营养缺陷型筛选法、营养缺陷型筛选法营养缺陷型筛选法的基本原理：营
173、养缺陷型筛选法的基本原理： 营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种能区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子便是转化子 氨基酸核苷酸常见的营养缺陷型筛选标记：常见的营养缺陷型筛选标记： 哺乳动物细胞中存在两条哺乳动物细胞中存在两条dttpdttp的合成途径：的合
174、成途径： 用于用于大肠杆菌大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trptrp 用于高等用于高等哺乳动物细胞哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因酶基因tktk，相应的受体细胞则选择相应的受体细胞则选择tktk- -缺陷型缺陷型dcdpdcdpdtdpdtdpdttpdttp胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷dtmpdtmpdtdpdtdpdttpdttpapaptktkap ap 氨基喋呤氨基喋呤tk tk 胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶显色筛选法显色筛选法显色筛选法的基本原理：显色筛选法的基本原理： 显色筛
175、选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒肠杆菌质粒puc18puc18携带的携带的laczlacz基因（蓝色反应）、链霉菌质粒基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pij702pij702携带的携带的melcmelc基因（黑色反应）等基因（黑色反应）等 互补现象（-半乳糖苷酶法）laczamn2h片段受体coohcooh片段供体
176、lacz载体遗传标记检测载体遗传标记检测显色筛选法显色筛选法显色筛选法的基本操作：显色筛选法的基本操作： puc18aprlaczoriap x-galap x-gal重组子（重组子（apaprr lacz lacz-） 将将外外源源基基因因克克隆隆在在puc18puc18的的laczlacz标标记记基基因因内内部部，使使之之灭灭活活，此此时时重重组组子子呈呈apaprr、laczlacz-，淡淡黄黄色色菌菌落落；而而非非重组子则呈重组子则呈apaprr、laczlacz ，蓝色菌落蓝色菌落 克隆克隆dnadna序列检测序列检测限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法 所谓的限制性酶切
177、图谱法就是对载体上插入的外源所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源dnadna片片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分此利用这种方法不仅能区分重组子重组子与非重组子，而且还能鉴定与非重组子，而且还能鉴定目的重组子目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。作量极大，实验成本也高。克隆克隆dnadna序列检测序列检测限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法全酶解图谱法：全酶解图谱法：puc18 puc18 2.7 kb2.7
178、kbhindiii sphi psti sali bamhi smai kpni ecorihindiii sphi psti sali bamhi smai kpni ecoriapaprrlaczlaczorioribbbbeepp4.0 kb4.0 kb1.0 kb1.0 kb0.8 kb0.8 kb区分重组子与非重组子区分重组子与非重组子用用bamhibamhi酶切转化子质粒酶切转化子质粒dnadna电泳观察酶解产物片段电泳观察酶解产物片段重组子：重组子： 2.7 2.7 kb 4.0 kbkb 4.0 kb非重组子：非重组子： 2.7 2.7 kbkb如果外源如果外源dnad
179、na片段也是片段也是2.7 2.7 kbkb，最好最好选用单一切口的酶将质粒线型化，然选用单一切口的酶将质粒线型化，然后通过其长度来鉴定其是否为重组子后通过其长度来鉴定其是否为重组子克隆克隆dnadna序列检测序列检测限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法全酶解图谱法：全酶解图谱法：puc18 puc18 2.7 kb2.7 kbhindiii sphi psti sali bamhi smai kpni ecorihindiii sphi psti sali bamhi smai kpni ecoriapaprrlaczlaczoriorissssbbpp4.0 kb4.0 kb1.0 kb1.0
180、 kb0.8 kb0.8 kb区分重组子与非重组子区分重组子与非重组子如果外源如果外源dnadna片段插在片段插在puc18puc18的的sphisphi位点处，原则上也可用位点处，原则上也可用sphisphi酶解鉴定，但这样做很不经济，酶解鉴定，但这样做很不经济，因为因为sphisphi非常昂贵（每非常昂贵（每100100单位单位5050美元）。用美元）。用hindiiihindiii和和ecoriecori联联合酶解同样可以达到目的，但这合酶解同样可以达到目的，但这两种酶的价格只及两种酶的价格只及sphisphi的的1 / 501 / 50 克隆克隆dnadna序列检测序列检测限制性酶切图
181、谱法限制性酶切图谱法全酶解图谱法：全酶解图谱法：puc18 puc18 2.7 kb2.7 kbhindiii sphi psti sali bamhi smai kpni ecorihindiii sphi psti sali bamhi smai kpni ecoriapaprrlaczlaczorioribamhibamhibamhibamhiecoriecoripstipsti4.0 kb4.0 kb1.0 kb1.0 kb0.8 kb0.8 kb区分目的重组子与非目的重组子区分目的重组子与非目的重组子用用ecoriecori酶切转化子质粒酶切转化子质粒dnadna目的重组子：目的重组
182、子： 3.0 3.0 kb 3.7 kbkb 3.7 kb 或者：或者： 1.0 1.0 kb 5.7 kb kb 5.7 kb 反向反向用用pstipsti酶切转化子质粒酶切转化子质粒dnadna目的重组子：目的重组子： 3.2 3.2 kb 3.5 kbkb 3.5 kb 或者：或者： 0.8 0.8 kb 5.9 kb kb 5.9 kb 反向反向2.2kb克隆克隆dnadna序列检测序列检测限制性酶切图谱法限制性酶切图谱法全酶解图谱法：全酶解图谱法：puc18 puc18 2.7 kb2.7 kbhindiii sphi psti sali bamhi
183、smai kpni ecorihindiii sphi psti sali bamhi smai kpni ecoriapaprrlaczlaczorioribbbbee4.0 kb4.0 kb2.0 kb2.0 kb2.0 kb2.0 kb区分目的重组子与非目的重组子区分目的重组子与非目的重组子对图示的克隆片段，转化子质粒对图示的克隆片段，转化子质粒dnadna用用ecoriecori酶切开后，只出现酶切开后，只出现2.0 2.0 kbkb和和2.7 2.7 kbkb两条带子，实际上两条带子，实际上2.0 2.0 kbkb的条带中含有两种不同的的条带中含有两种不同的分子分子2.7 kb2.7
184、 kb2.0 kb2.0 kbee5 5、原位杂交法（高通量筛选）、原位杂交法（高通量筛选）原理：基于分子杂交原理。原理：基于分子杂交原理。将转化子筛选平板上的菌落将转化子筛选平板上的菌落或噬菌斑进行影印至硝酸纤维膜上后，用碱法原位裂解和固定，或噬菌斑进行影印至硝酸纤维膜上后，用碱法原位裂解和固定，以放射性、地高锌或生物素荧光素标记的目的基因的同源序列以放射性、地高锌或生物素荧光素标记的目的基因的同源序列作探针，进行原位分子杂交分析，即可鉴定出对应的阳性重组作探针，进行原位分子杂交分析，即可鉴定出对应的阳性重组子。子。优缺点：优缺点：可高通量筛选，但操作繁杂、可高通量筛选，但操作繁杂、 常有假
185、阳性常有假阳性菌落原位杂交法的基本操作：菌落原位杂交法的基本操作：影印影印裂解、固定、裂解、固定、 洗涤洗涤杂交杂交感光感光用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板 用用0.40.4nn的的naohnaoh溶液浸泡影印薄膜（裂菌、变性溶液浸泡影印薄膜（裂菌、变性dna)dna) 用用sscssc溶液浸泡清洗影印薄膜溶液浸泡清洗影印薄膜 8080烘干固定影印薄膜烘干固定影印薄膜 薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温 用用ssc-sdsssc-sds液洗涤杂交薄膜液洗涤杂交薄膜 用用xx光胶片覆盖薄膜感光光胶片覆盖薄膜感光 杂交探针的制备：杂交探针的制备
186、：用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件：用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件：单链结构单链结构足够长度（至少足够长度（至少1212个个碱基）碱基） 内部不含互补区内部不含互补区 探针的制备方法或来源包括：探针的制备方法或来源包括：人工合成人工合成 cdnacdna合成合成 同源序列同源序列 mrnamrna 都有哪些标记方法？都有哪些标记方法？ （1）5端标记法端标记法 （2）反转录标记法）反转录标记法 （3）缺口前移标记）缺口前移标记 （4）abc标记法标记法 菌落噬菌斑原位杂交法菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：杂交探针的标记：abcabc荧光标记荧光标记gcttga
187、gcagtaacctggcttgagcagtaacctg荧光胺荧光胺biotin biotin 生物素生物素avidinavidin生物素结合蛋白生物素结合蛋白烷烃连接臂烷烃连接臂菌落噬菌斑原位杂交法菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：杂交探针的标记：abcabc显色酶标记显色酶标记gcttgagcagtaacctggcttgagcagtaacctg显色酶显色酶biotin biotin 生物素生物素avidin avidin 生物素结合蛋白生物素结合蛋白烷烃连接臂烷烃连接臂生色底物生色底物颜色产物颜色产物菌落噬菌斑原位杂交法菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：杂交探针的标记：地高辛标记系统地
188、高辛标记系统dutpdutp- -连接臂连接臂- -甾醇半抗原甾醇半抗原digoxigenin digdigoxigenin dig抗体抗体- -显色酶显色酶交联复合物交联复合物探针合成探针合成据已知序列合成据已知序列合成据已知氨基酸序列合成据已知氨基酸序列合成 在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其编码的编码的dnadna序列，然后合成探针。序列，然后合成探针。 由于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时由
189、于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时必须考虑下列问题：必须考虑下列问题：生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针探针应具有足够的长度，通常在探针应具有足够的长度，通常在17-2017-20个核苷酸之间个核苷酸之间探针内部不应出现可能的互补区域探针内部不应出现可能的互补区域探针等寡聚核苷酸合成探针等寡聚核苷酸合成某段连续的氨基酸序列某段连续的氨基酸序列cys met asp glu met lys arg asn ilecys met asp glu met lys arg asn ile所有可能的所有可能的dnadna序列序列tgttgta
190、tgatggacgacgaagaaatgatgaaaaaaagaagaaacaacataata c t c t g gatg atg g g g g t t t t c c cga cga cgg cgg cgt cgt cgc cgc设计的简并探针序列设计的简并探针序列tgtgt tatgatggagac cgagai iatgatga atgtgt tatgatggagat tgagai iatgatga atgtgc catgatggagac cgagai iatgatga atgtgc catgatggagat tgagai iatgatga a a a g g此外还可以参考各种生物体
191、的此外还可以参考各种生物体的estest数据库进行倾向性简并序列设计数据库进行倾向性简并序列设计expressed sequence tagexpressed sequence tag6 6 6 6、蛋白质生物功能测定法（高通量筛选）、蛋白质生物功能测定法（高通量筛选）、蛋白质生物功能测定法（高通量筛选）、蛋白质生物功能测定法（高通量筛选）淀粉酶目的基因的鉴定：淀粉酶目的基因的鉴定： 淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶于水淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶于水的淀粉加入固体培养基内，培养基呈混浊状。将的淀粉加入
192、固体培养基内，培养基呈混浊状。将待鉴定的重组克隆涂布在此培养基上，含目的基因的目的重组子可待鉴定的重组克隆涂布在此培养基上，含目的基因的目的重组子可其表达的淀粉酶分泌出胞外，并均匀扩散，同时降解淀粉为可溶性其表达的淀粉酶分泌出胞外，并均匀扩散，同时降解淀粉为可溶性的多糖或单糖。因此，目的重组子菌落周围会形成透明圈。如果透的多糖或单糖。因此，目的重组子菌落周围会形成透明圈。如果透明圈不明显，还可往培养板上喷碘，使淀粉所在区域呈蓝色本底，明圈不明显，还可往培养板上喷碘，使淀粉所在区域呈蓝色本底，易于辨认。易于辨认。 蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用类似的方法进行鉴定蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用
193、类似的方法进行鉴定蛋白质生物功能测定法蛋白质生物功能测定法抗菌素抗性基因的鉴定：抗菌素抗性基因的鉴定： 抗抗菌菌素素抗抗性性基基因因表表达达的的蛋蛋白白质质能能使使受受体体细细胞胞产产生生对对该该抗抗生生素素的的抗抗性性。据据此此，只只需需往往培培养养板板中中加加入入适适量量抗抗生生素素，理理论论上上长长出出的的菌落即是含有目的基因的目的重组子菌落即是含有目的基因的目的重组子 在在实实际际操操作作过过程程中中，由由于于抗抗生生素素有有时时会会诱诱导导受受体体细细胞胞产产生生抗抗性性，因因此此必必须须从从抗抗性性重重组组克克隆隆中中抽抽出出重重组组质质粒粒，二二次次转转化化受受体体细细胞胞。如如
194、果果此此时时转转化化平平板板上上出出现现大大量量的的抗抗性性菌菌落落，即即可可认认为为这这种种抗抗性确由目的基因的编码产物产生性确由目的基因的编码产物产生蛋白质生物功能测定法蛋白质生物功能测定法抗菌素抗性基因的鉴定：抗菌素抗性基因的鉴定： 目的重组子目的重组子 诱导抗性诱导抗性 抽取重组质粒抽取重组质粒再次转化再次转化 菌落菌落pcrpcr法法 pcrpcr（polymerase chain reactionpolymerase chain reaction）法，又称为法，又称为聚合酶聚合酶链反应链反应或或pcrpcr扩增技术扩增技术，是一种高效快速的体外，是一种高效快速的体外dnadna聚合
195、程序聚合程序 使用使用pcrpcr法克隆目的基因的前提条件是：法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的已知待扩增目的基因或基因或dnadna片段两侧的序列片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必，根据该序列化学合成聚合反应必 需的双引物需的双引物 pcrpcr法定向扩增目的基因的基本原理法定向扩增目的基因的基本原理三、重组子的确证三、重组子的确证dnadna序列分析序列分析双脱氧末端终止测序法的基本原理：双脱氧末端终止测序法的基本原理： dnadna序序列列测测定定是是精精确确鉴鉴定定目目的的基基因因的的重重要要手手段段，目目前前国国际际上上流流行行采采用用sangersanger发发明
196、明的的双双脱脱氧氧末末端端终终止止法法测测定定dnadna序序列列，其其工工作作原原理理是是在在dnadna聚聚合合反反应应的的进进程程中中，通通过过位位点点特特异异性性终终止止测测定定dnadna序序列列其关键技术有：其关键技术有：dnadna链聚合反应时的定点随机中断（链聚合反应时的定点随机中断（ddntpddntp）聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率（聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率（600 600 bp / 601 bpbp / 601 bp）电脑自动检测、记录、编辑程序电脑自动检测、记录、编辑程序用于用于dnadna测序的专一性试剂盒（测序的专一性试剂盒（kitkit）sangerdnadna
197、序列分析法序列分析法双脱氧末端终止测序法的基本操作：双脱氧末端终止测序法的基本操作： aa cc gg tt ssdnassdna ssdnassdna ssdnassdna ssdnassdna primerprimer primerprimer primerprimer primerprimer klenowklenowklenowklenowklenowklenowklenowklenowdntpsdntpsdntpsdntpsdntpsdntpsdntpsdntpsddatpddatpddctpddctpddgtpddgtpddttpddttpaa gg tt cc dnadna聚合反
198、应聚合反应聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳dnadna序列分析法序列分析法双脱氧末端终止测序法的基本反应：双脱氧末端终止测序法的基本反应： klenowoh 35 ptdntp ddatp tttttoh 35 paa gg tt cc ggcattgcgttactagtccagtacaggcattgcgttactagtccagtaca第二代测序-roche 454测序系统第二代测序-roche 454测序系统第二代测序-roche 454测序系统每个碱基的加入，释放一个焦磷酸，转换成一个荧光信号每个碱基的加入，释放一个焦磷酸，转换成一个荧光信号第第第二代测序solexa系统第二代测序
199、solexa系统纳米孔单分子测序技术第三代测序ldna碱基通过纳米孔时，它们使电荷发生变化l从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度l每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的四、表达鉴定（工程细胞）四、表达鉴定（工程细胞）四、表达鉴定（工程细胞）四、表达鉴定（工程细胞）聚丙烯酰胺凝胶电泳法（聚丙烯酰胺凝胶电泳法（聚丙烯酰胺凝胶电泳法（聚丙烯酰胺凝胶电泳法（sds-pagesds-page）westernblotwesternblot（免疫印迹法）（免疫印迹法）（免疫印迹法）（免疫印迹法） 以目的基因产物的单抗或多抗以目的基因产物的单抗或多抗以目的基因产物的单抗或多抗以目的基因产物的单抗或多抗进行。进行。
200、进行。进行。第二章 分子克隆单元操作2.2 2.3 2.1 克隆载体克隆载体dnadna的体外重组（切与接）的体外重组（切与接）目的基因的克隆目的基因的克隆2.4 转化与扩增（转与增）转化与扩增（转与增）转化子的筛选与重组子的鉴定（检）转化子的筛选与重组子的鉴定（检）2.5 2.52.5 目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建c pcrc pcr法法b cdnab cdna法法a a 鸟枪法鸟枪法d d 化学合成化学合成法法e e 基因文库的构建基因文库的构建2.52.5 目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建 基因工程或基因工程或dnadna重组技
201、术三大用途的前提条件是从生物体基因组重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。 一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一般来说，目的基因的克隆战略
202、分为两大类：一类是构建感兴趣一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是一类是利用利用pcrpcr扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然，然后将之克隆表达。后将之克隆表达。a a 鸟枪法鸟枪法2.52.5 目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建鸟枪法克隆目的基因的基本策略鸟枪法克隆目的基因的基本策略鸟枪法操作
203、的改进鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法鸟枪法鸟枪法鸟枪法- -散弹射击法散弹射击法 nn将供体细胞中的将供体细胞中的dnadna切成许多片段，将这些片段分别载切成许多片段，将这些片段分别载入载体，入载体，nn然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的所提供的dnadna的所有片段分别在各个细胞中大量复制的所有片段分别在各个细胞中大量复制nn从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的目的基因的dnadna片段分离出来。如许多抗虫抗
204、病毒的基片段分离出来。如许多抗虫抗病毒的基因都可以用上述方法获得。因都可以用上述方法获得。 鸟枪法克隆目的基因的基本策略鸟枪法克隆目的基因的基本策略染色体染色体dnadna的切断的切断 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切：全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开， 大小不可控大小不可控 部分酶切：部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整 与载体连接与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切
205、图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为转化受体细胞转化受体细胞 受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞的受体细胞筛选含有目的基因的目的重组子筛选含有目的基因的目的重组子
206、菌落原位杂交法菌落原位杂交法、基因产物功能检测法基因产物功能检测法（筛选模型的建立）（筛选模型的建立） 鸟枪法克隆目的基因的基本策略鸟枪法克隆目的基因的基本策略 随机克隆随机克隆供体细胞的供体细胞的全基因组全基因组dnadna片段，然后通过快速有效的片段，然后通过快速有效的筛选筛选程序从程序从众多克隆中分离出含有目的基因的众多克隆中分离出含有目的基因的目的目的重组子重组子，进而获得目的基因。鸟枪法，进而获得目的基因。鸟枪法适适用于原核细菌目的基因的克隆分离用于原核细菌目的基因的克隆分离（真核基因含有内含子）（真核基因含有内含子） 鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进使用这一改进方法的前提条件是：目
207、的基因的酶切图谱已知。使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体dnadna，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中重组子中目的重组子目的重组子的出现频率的出现频率 （减少工作量）（减少工作量）使用特征性限制性内切酶切开染色体使用特征性限制性内切酶切开染色体dnadna 鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进例如，例如，已知某目的基因位于已知某目的基因位于1.8 1.8 kbkb的的sal isal i片段中，片段中
208、，将染色体将染色体dnadna用用sal isal i切开，琼切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6 - 2.01.6 - 2.0 kbkb大小区域内的凝胶块，从此大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收凝胶块中回收dnadna片段，然后与载体进片段，然后与载体进行拼接行拼接在连接前将在连接前将dnadna片段进行分级分离片段进行分级分离 2.0 kb1.6 kb1.8 kb鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进纸片法纸片法冻融法冻融法吸附法吸附法低融点凝胶法低融点凝胶法溶解法溶解法凝胶凝胶dnadna片段回收技术片段回收技术 纸片法纸片法其余方法其余方法鸟枪
209、法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得最小长度的目的基因不能获得最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构不能除去真核生物目的基因的内含子结构b cdnab cdna法法2.52.5 目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建cdnacdna法克隆目的基因的基本策略法克隆目的基因的基本策略cdnacdna法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序cdnacdna法法克隆目的基因的局限性法法克隆目的基因的局限性cdnacdna法克隆目的基因的基本策略法克隆目的基因的基
210、本策略mdnamdnac cdnadna第一链的合成第一链的合成 55pppppp55g g aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaohoh 3355pppppp55g g aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaohoh 33ttttttttttttttttttttttttttttpp 5555pppppp55g g aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaohoh 33ttttttttttttttttttttttttttttpp 55cdnacdna第一链第一链引物引物退火退火逆转录酶逆转录酶dntpsdntpsc cdnadna第二链的合
211、成第二链的合成 煮沸煮沸naohnaoh自身引导法：获得的双链自身引导法：获得的双链cdna cdna 55端会有几对碱基缺失。端会有几对碱基缺失。aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa55pppppp55g g aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaohoh 33ttttttttttttttttttttttttttttpp 55ttttttttttttttttttttttttttttpp 55ttttttttttttttttttttttttttttpp 55aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaohoh 33ttttttttttttttt
212、tttttttttttttohoh 33klenowklenowdntpsdntpss1s1c cdnadna第二链的合成第二链的合成 dnapol dntpsdnapol dntpsrnaeshrnaesh置换合成法：获得的双链置换合成法：获得的双链cdna cdna 55端也会有几对碱基缺失（不用端也会有几对碱基缺失（不用s1s1则否）则否）55ppp5ppp5g g aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaohoh 33ttttttttttttttttttttttttttttpp 55aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaapp 5555s1s1 aaaa
213、 aaaaohoh 33ttttttttttttttttttttttttttttpp 5555ttttttttttttttttttttttttttttohoh 33aaaaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaa 5555tttttttttttttt tttttttttttttt 3333t4-dna ligaset4-dna ligasec cdnadna第二链的合成第二链的合成 dctpdctptdttdt引导合成法：引导合成法：获得的双链获得的双链cdna cdna 能保留完整的能保留完整的55端序列端序列55pppppp55g g aaaaaaaaaaohoh 33ttttt
214、tttttpp 5533 hoho55pppppp55g g aaaaaaaaaaccccccccccccccohoh 3333 hohoccccccccccccccttttttttttpp 5533 hohoccccccccccccccttttttttttpp 5533 hohoccccccccccccccttttttttttpp 5555 ppgggggggggggggg33 hohoccccccccccccccttttttttttpp 5555 ppggggggggggggggaaaaaaaaaaohoh 33naohnaoh退火退火klenowklenowdntpsdntpscdnac
215、dna法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略双链双链c cdnadna的克隆的克隆 双链平头的双链平头的cdnacdna通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：通常可以使用下列三种方法克隆入载体中： 平头末端直接与载体连接，平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，平头两端分别接同聚物尾，最好是最好是atat同聚物尾，这样重组同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和分子可通过加热局部变性和s1s1核酸酶处理回收插入片段核酸酶处理回收插入片段加装人工接头引入酶切口，加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收以便插入片段回收 cdnacdna
216、法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序完备分离程序完备分离程序 提提取取细细胞胞总总mrnamrna，合合成成总总cdnacdna，将将之之全全部部克克隆隆，然然后后借助于合适的筛选手段找到目的重组子借助于合适的筛选手段找到目的重组子 筛筛选选时时，若若使使用用的的是是克克隆隆载载体体，则则采采用用菌菌落落原原位位杂杂交交法法筛筛选；若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选选；若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选 完备分离程序适用于完备分离程序适用于mrnamrna分子数少的目的基因的克隆，分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子如人胰岛素基因、
217、干扰素基因、凝血因子viiiviii基因等基因等 cdnacdna法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序特异分离程序特异分离程序 提提取取细细胞胞总总mrnamrna，琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳分分离离，回回收收目目标标mrnamrna，由此合成双链由此合成双链cdnacdna，然后进行克隆然后进行克隆 特特异异分分离离程程序序较较适适用用于于mrnamrna丰丰度度极极高高的的目目的的基基因因克克隆隆如血红蛋白基因等如血红蛋白基因等 cdnacdna法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序差异分离程序差异分离程序 利用两组细胞利用两组细胞mrnamrna种类的差异，分离克
218、隆差异种类的差异，分离克隆差异mrnamrna所对所对应的应的cdnacdna，因而这种程序较适用于因而这种程序较适用于分离克隆新基因分离克隆新基因 例如：正常的大鼠例如：正常的大鼠fr3t3fr3t3成纤维细胞中，有些新基因是不能成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能隆这些新基因，进而研究其生物学功能 差异分离程序差异分离程序 多瘤病毒感染的多瘤病毒感染的fr3t3fr3t3细胞细胞正常的正常的fr3t3fr3t3细胞细胞总总mrnamrna总总mrnam
219、rnacdnacdna双链双链cdnacdna单链单链cdnacdna作为探针作为探针提取提取mrnamrna合成合成cdnacdna合成第二链合成第二链克隆克隆提取提取mrnamrnamrna-mrna-cdnacdna杂交杂交上柱上柱原位杂交原位杂交病毒诱导表达的基因病毒诱导表达的基因cdnacdna克隆克隆杂交分子杂交分子被吸附被吸附cdnacdna法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性并非所有的并非所有的mrnamrna分子都具有分子都具有polyapolya结构结构 细菌或原核生物的细菌或原核生物的mrnamrna半衰期很短半衰期很短mrnamrna在细胞中含量少，对酶和碱极为
220、敏感，在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难分离纯化困难仅限于克隆蛋白质编码基因仅限于克隆蛋白质编码基因 c pcrc pcr法法2.52.5 目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建 pcrpcr（polymerase chain reactionpolymerase chain reaction）法，又称为法，又称为聚合酶聚合酶链反应链反应或或pcrpcr扩增技术扩增技术，是一种高效快速的体外，是一种高效快速的体外dnadna聚合程序聚合程序 使用使用pcrpcr法克隆目的基因的前提条件是：法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的已知待扩增目的基因或基因或dn
221、adna片段两侧的序列片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必，根据该序列化学合成聚合反应必 需的双引物需的双引物 pcrpcr法定向扩增目的基因的基本原理法定向扩增目的基因的基本原理 由由taq dnataq dna聚合酶扩增的聚合酶扩增的pcrpcr产物中，其产物中，其33末端总是会带有末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是a a，因为因为taq dnataq dna聚合酶对聚合酶对datpdatp具有优先聚合活性。由于该突出碱基的具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取存在，克隆时即可以采取tdt
222、tdt末端加同聚尾的方法与载体拼接，末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的也可以使用专门的t t载体载体克隆克隆 pcrpcr克隆目的基因的基本程序克隆目的基因的基本程序5555aaaatttt5555pcrpcr扩增产物扩增产物t t 载体载体t7t7laczlaczmcsmcsorioriapaprrd d 化学合成法化学合成法2.52.5 目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建化学合成法的基本策略化学合成法的基本策略化学合成的单元操作化学合成的单元操作dnadna化学合成的用途化学合成的用途化学合成法的基本策略化学合成法的基本策略全基因合成全基因合成化学合成
223、目的基因的前提条件是基因的化学合成目的基因的前提条件是基因的dnadna序列已知，有三种策略：序列已知，有三种策略：小片段粘接法：小片段粘接法： 混合退火混合退火根据目的基因全序列，分别合成根据目的基因全序列，分别合成12-1512-15碱基长的碱基长的单链单链dnadna小片段小片段t4-dnat4-dna连接酶连接连接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体 化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略全基因合成全基因合成补钉延长法：补钉延长法： 混合退火混合退火根据目的基因根据目的基因两条互补链两条互补链全序列，分别合成全序列，分别合成12-1512-15碱基长的单链碱基长的单链dnadna小
224、片段以及小片段以及20-3020-30碱基长的单链碱基长的单链dnadna中片段中片段t4-dnat4-dna连接酶连接连接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体 klenowklenow酶聚合酶聚合化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略全基因合成全基因合成大片段酶促法：大片段酶促法： 混合退火混合退火根据目的基因根据目的基因的的全序列，分别合成全序列，分别合成40-5040-50碱基长的单链碱基长的单链dnadna片段片段t4-dnat4-dna连接酶连接连接酶连接克隆入合适的载体克隆入合适的载体 klenowklenow酶聚合酶聚合化学合成法的基本策略化学合成法的基本策略全基因合成全基因
225、合成 上述三种方法各有利弊：化学合成上述三种方法各有利弊：化学合成dnadna的的单片段愈短，收率就单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95�%则合成则合成5050个碱基长的个碱基长的dnadna单链大片段的总收率只有单链大片段的总收率只有7.7%7.7%e e 基因文库的
226、构建基因文库的构建2.52.5 目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建基因文库的基本概念基因文库的基本概念基因文库的构建程序基因文库的构建程序基因组文库重组克隆的排序基因组文库重组克隆的排序基因文库的基本概念基因文库的基本概念基因库与基因文库基因库与基因文库基因库（基因库（gene poolgene pool） 特定生物体全基因组的集合（特定生物体全基因组的集合（天然存在天然存在） 基因文库（基因文库（gene library or gene bankgene library or gene bank） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因从特定生物个体中分离的全部基
227、因，这些基因以克隆的形式以克隆的形式基因组文库基因组文库（含有全部基因）（含有全部基因） 存在存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为：（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为： cdnacdna文库文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）（含有全部蛋白质编码的结构基因） 基因文库的基本概念基因文库的基本概念基因文库构建的基本策略基因文库构建的基本策略用鸟枪法构建基因组文库，用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体材料来自染色体dnadna用用cdnacdna法构建法构建cdnacdna文库，文库，材料来自材料来自mrnamrna在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的在高度
228、分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mrnamrna种类不同（即种类不同（即基因的表达谱基因的表达谱不同），因此同种生物体的不同），因此同种生物体的cdnacdna文库文库一般还有一般还有组织细胞的界定组织细胞的界定，如肝组织，如肝组织cdnacdna文库或胚胎组织文库或胚胎组织cdnacdna文库等。很显然，文库等。很显然， cdnacdna文库的信息量远小于基因组文库文库的信息量远小于基因组文库基因文库的基本概念基因文库的基本概念基因文库的完备性基因文库的完备性基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因
229、文库最低所含克隆数率，它与基因文库最低所含克隆数nn之间的关系可用下式表示：之间的关系可用下式表示：n = ln ( 1 p ) / ln ( 1 f )n = ln ( 1 p ) / ln ( 1 f )其中：其中： p = p = 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率 f = f = 克隆片段的平均大小克隆片段的平均大小 / / 生物基因组的大小生物基因组的大小 例如，人的单倍体例如，人的单倍体dnadna总长为总长为2.9 2.9 x 10x 1099 bp bp，基因文库中克隆片段基因文库中克隆片段的平均大小为的平均大小为15 15 k
230、bkb，则构建一个完备性为则构建一个完备性为0.90.9的的基因文库至少需要基因文库至少需要4545万个克隆；而当完备性提高到万个克隆；而当完备性提高到0.99990.9999时，基因文库至少需要时，基因文库至少需要180180万个克隆万个克隆in（10.99） n = in （11.51033109）基因文库的基本概念基因文库的基本概念基因文库的质量标准基因文库的质量标准除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基
231、因的长度载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选重组克隆能稳定保存、扩增、筛选基因文库的构建程序基因文库的构建程序基因组基因组dnadna的切割的切割 用于基因组用于基因组文库构建的文库构建的dnadna片段的切割一般采用超声波处理和片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是： 第一，保证第一，保证dna
232、dna片段之间存在部分重叠区片段之间存在部分重叠区 第二，保证第二，保证dnadna片段大小均一片段大小均一超声波处理后的超声波处理后的dnadna片段呈平头末端，需加装人工接头片段呈平头末端，需加装人工接头 部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：如：sau3aisau3ai或或mboimboi等，这样等，这样dnadna酶解片段的大小可控酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的连接前，上述处理的dnadna片段必须根据载体的装载量进行分级片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的分离，以杜绝不相干的dnadna片段随机连
233、为一体！片段随机连为一体！基因文库的构建程序基因文库的构建程序载体和受体的选择载体和受体的选择 出于压缩重组克隆的数量，用于基因组出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的文库构建的载体通常选载体通常选装载量较大的装载量较大的l l-dna-dna或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用人类）需使用yacyac或或bacbac载体载体ll-dna-dna 由于绝大多数真核生物的由于绝大多数真核生物的mrnamrna小于小于10 10 kbkb，因此用于因此用于cdnacdna文库构文库构建的载体建的载体通常选质粒通常选质粒 上述几种上述几种载体
234、的最大装载量如下：载体的最大装载量如下：质粒质粒考斯质粒考斯质粒110 kb0 kb25 25 kbkb45 45 kbkbbacbac300 300 kbkbyacyac400 400 kbkb 用于基因用于基因文库构文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌基因文库的构建程序基因文库的构建程序从基因文库中筛选目的基因从基因文库中筛选目的基因 大型基因组大型基因组文库文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除了一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白了一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基
235、因、结合蛋白编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选法、程序（如抗药性筛选法、酵母双杂交技术等）直接筛选外，一般的基因组酵母双杂交技术等）直接筛选外，一般的基因组文库筛选均需多轮文库筛选均需多轮操作步骤操作步骤从基因文库中筛选目的基因从基因文库中筛选目的基因目的基因背景知识目的基因背景知识目的基因的部分或全部碱基序列已知目的基因的部分或全部碱基序列已知目的基因编码产物的结构或功能已知目的基因编码产物的结构或功能已知目的基因与某些生物表型（如疾病）的相关性已知目的基因与某些生物表型（如疾病）的相关性已知基因文库的构建程序基因文库的构建程序从基因文
236、库中筛选目的基因（原位杂交法）从基因文库中筛选目的基因（原位杂交法）密集铺板（密集铺板（1-101-10万）万）杂杂交交挖挖取取铺铺板板铺铺板板目的重组克隆目的重组克隆基因文库的构建程序基因文库的构建程序基因文库构建的技术性问题基因文库构建的技术性问题在基因组在基因组文库的构建过程中，文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：最应引起重视的问题是：严禁外源严禁外源dnadna片段之间的连接！片段之间的连接！为了避免上述情况的发生，为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合：可采取下列措施的组合： 将待连接的将待连接的dnadna片段根据载体的装载量分级分离片段根据载体的装载量分级分离用碱性磷酸
237、单酯酶除去用碱性磷酸单酯酶除去dnadna片段的末端磷酸基团片段的末端磷酸基团 用用tdttdt酶在酶在dnadna片段的末端上增补同聚尾末端片段的末端上增补同聚尾末端 获得目的基因方法的选择获得目的基因方法的选择获得目的基因方法的选择获得目的基因方法的选择一、根据获得目的基因的研究目的选择方法一、根据获得目的基因的研究目的选择方法一、根据获得目的基因的研究目的选择方法一、根据获得目的基因的研究目的选择方法 为了研究基因全长结构、调控、为了研究基因全长结构、调控、为了研究基因全长结构、调控、为了研究基因全长结构、调控、dnadna信息分析信息分析信息分析信息分析 构建基因组文库构建基因组文库构
238、建基因组文库构建基因组文库 为了开展目的基因重组表达为了开展目的基因重组表达为了开展目的基因重组表达为了开展目的基因重组表达 制药、治疗制药、治疗制药、治疗制药、治疗 构建构建构建构建cdnacdna文库。文库。文库。文库。 若目的基因序列明确可设计引物通过若目的基因序列明确可设计引物通过若目的基因序列明确可设计引物通过若目的基因序列明确可设计引物通过pcr/rt-pcrpcr/rt-pcr克隆。克隆。克隆。克隆。 若目的基因序列短小可化学合成。若目的基因序列短小可化学合成。若目的基因序列短小可化学合成。若目的基因序列短小可化学合成。二、根据目的基因本身特点选择方法二、根据目的基因本身特点选择
239、方法二、根据目的基因本身特点选择方法二、根据目的基因本身特点选择方法 对从基因组中克隆的基因对从基因组中克隆的基因对从基因组中克隆的基因对从基因组中克隆的基因( (内含子内含子内含子内含子) ) 只能真核表达只能真核表达只能真核表达只能真核表达 对从对从对从对从cdnacdna中克隆的基因中克隆的基因中克隆的基因中克隆的基因( (无内含子无内含子无内含子无内含子) ) 可在原核可在原核可在原核可在原核/ /真核表达真核表达真核表达真核表达 要选择要选择要选择要选择mrnamrna表达丰富的组织材料，表达丰富的组织材料，表达丰富的组织材料，表达丰富的组织材料，pcrpcr克隆的基因必须测序。克隆
240、的基因必须测序。克隆的基因必须测序。克隆的基因必须测序。三、根据实验室设备条件选择方法三、根据实验室设备条件选择方法三、根据实验室设备条件选择方法三、根据实验室设备条件选择方法 构建文库无需自行构建，有商品出售。构建文库无需自行构建，有商品出售。构建文库无需自行构建，有商品出售。构建文库无需自行构建，有商品出售。 目的基因序列明确，也无需建库，可直接用目的基因序列明确，也无需建库，可直接用目的基因序列明确，也无需建库，可直接用目的基因序列明确，也无需建库，可直接用pcr/rt-pcrpcr/rt-pcr克隆克隆克隆克隆。重要生命科学网站重要生命科学网站重要生命科学网站重要生命科学网站nn丁香园丁香园丁香园丁香园nn医网琴声医网琴声医网琴声医网琴声nnwww.bio-www.bio-www.bio-www.bio-